快速鑒定南瓜實蠅的ss-pcr特異性引物及試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及檢疫性害蟲檢測領(lǐng)域，快速鑒定南瓜實蠅的SS-PCR特異性引物及試 劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 南瓜實幡Bactrocera(Zeugodacus)tau(Walker)是一種入侵重大檢疫性害蟲，屬 雙翅目Diptera實幡科Tephritidae果實幡屬Bactrocera果實幡亞屬Bactrocera。南瓜 實蠅是農(nóng)業(yè)上的重要害蟲，現(xiàn)今在日本、越南、老撾、柬埔寨、泰國、馬來西亞、菲律賓、印度 尼西亞、不丹、印度、斯里蘭卡以及中國等國家均有分布。在進(jìn)出境的果蔬中經(jīng)常截獲各種 不同的實蠅的幼蟲、卵或蛹，甚至為頭、胸、翅、足等殘體，對于幼蟲的分類鑒定要比成蟲要 困難得多，為了保證鑒定的準(zhǔn)確性通常是將幼蟲在室內(nèi)飼養(yǎng)為成蟲，而這需要花費較長的 時間，嚴(yán)重影響了水果進(jìn)出口貿(mào)易的通關(guān)速度；而對于殘體則是無法對其進(jìn)行正確的識別。
[0003] 近年來，以研宄基因結(jié)構(gòu)和功能為主的現(xiàn)代分子生物學(xué)和以DNA重組技術(shù)為核心 的生物技術(shù)研宄取得了突飛猛進(jìn)的發(fā)展，預(yù)示著分子生物技術(shù)將成為21世紀(jì)的新興重點 學(xué)科。分子生物學(xué)技術(shù)主要針對于形態(tài)特征極其相似的近緣種、復(fù)合種及種以下的亞種、生 物型、地理種群的識別和鑒定，能解決傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)分類方法難以解決的問題。因此，迫切 需要發(fā)展有關(guān)于實蠅的快速鑒定識別的技術(shù)。
[0004] 種特異引物PCR(Species-specificPCR，SS-PCR)技術(shù)是與通用引物 PCR(universal-primersPCR，UR-PCR)技術(shù)相區(qū)別而提出來的，兩種技術(shù)的原理相似，只是 種特異引物PCR技術(shù)在根據(jù)靶序列設(shè)計引物時，要充分考慮引物的特異性，能夠在擴增未 知模版時，通過檢測目標(biāo)片段的有無就能把目標(biāo)種和其它種鑒別開來。
[0005] 對于卵或頭、胸、翅、足等殘體的檢測，樣本中僅存微粒靶標(biāo)DNA，因此，需要設(shè)計的 種特異引物具有極高的靈敏性；同時，樣本中可能混有近源物種，因此要求設(shè)計的種特異引 物具有加強的特異性?，F(xiàn)有技術(shù)雖然提供了根據(jù)已知序列設(shè)計擴增引物的軟件，但不能解 決如何兼具靈敏性和特異性的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供快速鑒定南瓜實蠅的SS-PCR特異性引物。
[0007] 本發(fā)明的再一目的是提供快速鑒定南瓜實蠅的試劑盒。
[0008] 本發(fā)明的再一目的是提供快速鑒定南瓜實蠅的方法。
[0009] 根據(jù)本發(fā)明的快速鑒定南瓜實蠅的SS-PCR特異性引物包括：
[0010] NF404 :5'TGCCTTAGCGATATTCTGGCT3' ；
[0011] NR610 :5'AACTGTGTTCAGCAGGTGGT3'。
[0012] 上述引物對擴增得到的鑒定南瓜實蠅的特異性片段的序列為：
[0013] 5 '-AGGATGAACAGTTTACCCACCCCTATCGTCTATTATTGCTCATGGAGGAGCATCAGTTGATTTAGC AATTTTTTCTTTACACCTAGCAGGAATCTCATCTATTTTAGGGGCTGTAAATTTTATTACTACAGTCATTAATATAC GATCAACAGGAATTACTTTCGATCGAATACCTTTATTTGTTTGAGCCGTTGTATTAACTGCCCTCCTTTTATTACTT TC-3'
[0014] 本發(fā)明提供了一種采用特異性引物快速鑒定南瓜實蠅的方法，能夠準(zhǔn)確及時對截 獲的疑似南瓜實蠅的卵、蛹、幼蟲、成蟲及殘體等進(jìn)行鑒定，建立了一種快速鑒定南瓜實蠅 的方法。
[0015] 根據(jù)本發(fā)明的【具體實施方式】，通過種特異引物PCR(SS-PCR)和瓊脂糖凝膠電泳技 術(shù)，篩選出了 1對南瓜實蠅的特異性引物，引物序列為：NF404:TGCCTTAGCGATATTCTGGCT; NR610 :AACTGTGTTCAGCAGGTGGT。選用番石榴實蠅、桔小實蠅、顏帶實蠅、銹實蠅、瘤脛實蠅、 楊桃實蠅、瓜實蠅、辣椒實蠅、具條實蠅、近黑顏實蠅、黑膝實蠅、滇寡鬃實蠅、何氏華實蠅、 棗實蠅、瓜棍腹實蠅、腿端黑實蠅、黑顏實蠅等作為陰性對照來證明本發(fā)明設(shè)計的引物的特 異性，大大縮短了南瓜實蠅的鑒定周期。
[0016] 本發(fā)明具體提供了一種采用特異性引物快速鑒定南瓜實蠅的方法，具體方法如 下：
[0017] (1)通過種特異引物PCR(SS-PCR)和瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)，篩選出了 1對南 瓜實蠅的特異性引物NF404和NR610。SS-PCR在定量梯度PCR儀上進(jìn)行，反應(yīng)體系： 2XEasyTaqPCRSuperMix12.5uL，引物各luL，模板各 2uL，加ddH20 至總體積 25uL; 反應(yīng)條件為 94°C/5min，94°C/40s，62°C/30s，72°C/lmin，30 個循環(huán)，最后延伸 7min; 分別提取5uLPCR產(chǎn)物在含DNA染色劑的1.5 %的瓊脂糖凝膠多功能電泳儀上電泳 30min(120V)，利用凝膠成像分析儀檢測是否擴增出預(yù)期大小的目標(biāo)片段，拍攝并記錄結(jié) 果。最終獲得一對特異性引物NF404和NR610,該對引物可以快速、準(zhǔn)確、特異性地檢測出 南瓜實蠅的各個蟲態(tài)甚至殘體，引物序列為：NF404 :5'TGCCTTAGCGATATTCTGGCT3' ；NR610 : 5'AACTGTGTTCAGCAGGTGGT3'。
[0018] (2)采用SS-PCR引物的種特異性的檢驗：選用番石榴實蠅、桔小實蠅、顏帶實蠅、 銹實蠅、瘤脛實蠅、楊桃實蠅、瓜實蠅、辣椒實蠅、具條實蠅、近黑顏實蠅、黑膝實蠅、滇寡鬃 實蠅、何氏華實蠅、棗實蠅、瓜棍腹實蠅、腿端黑實蠅、黑顏實蠅作為陰性對照，南瓜實蠅為 陽性對照，驗證南瓜實蠅特異性引物的種特異性。結(jié)果表明，僅南瓜實蠅在207bp處有一條 特異性擴增的條帶，陰性對照均無特異性目標(biāo)片段，從而證明該引物在實驗涉及的這些實 蠅種類范圍內(nèi)，能特異性的鑒定南瓜實蠅。
[0019] 一方面，引物的特異性是本實驗成功的關(guān)鍵，特異性片段要有足夠變異能夠?qū)⒉?同物種區(qū)分開。另一方面，當(dāng)口岸僅發(fā)現(xiàn)卵或是殘體時，即只能提取到微量DNA時，SS-PCR 檢測鑒定方法的靈敏度就至關(guān)重要了。根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案具有較高的靈敏度，能檢測 到的DNA模板濃度可低至57. 41X1(T2,同時該SS-PCR特異性引物能夠穩(wěn)定區(qū)分近似物種， 因此，本發(fā)明的檢測鑒定方法在實際檢疫工作中也得到應(yīng)用和驗證。
[0020] 綜上所述，本發(fā)明所建立的SS-PCR快速鑒定南瓜實蠅的方法具有快速簡便、特異 性尚、靈敏度尚等優(yōu)點，可以在8小時之內(nèi)完成南瓜實幡的鑒定，能夠滿足口岸檢驗檢疫快 速通關(guān)的要求。
【附圖說明】
[0021] 圖1顯示引物NF404和NR610的種特異性驗證，M:100bpDNALadder，1 :南瓜實 幡B.tau，2 :番石植實幡B.correcta，3 :桔小實幡B.dorsalis，4 :顏帶實幡B.cilifer， 5 :南瓜實幡B.rubigina，6:瘤腔實幡B.tuberculata，7 :楊桃實幡B.carambolae，8:瓜實 幡B.cucurbitae，9 :辣椒實幡B.latifrons，10 :具條實幡B.scutellata，11 :近黑顏實幡 B.parater，12 :黑膝實幡B.scutellaris，13 :何氏華實幡B.hochii，14 :賽實幡Carpomya vesuviana，15 :瓜棍腹實幡Dacuslongicornis，16 :腿端黑實幡B.atrifemur，17 :黑顏實 幡B.diaphora，18 :空白對照ddH20 ;
[0022] 圖2顯示SS-PCR快速鑒定南瓜實蠅的應(yīng)用與驗證，M:100bpDNALadder，1-17 : 南瓜實幡B.tau，18 :具條實幡B.scutellata，19 :瓜實幡B.cucurbitae，20 :空白對照dd H20;
[0023]圖 3 顯示引物NF404 和NR610 的靈敏度驗證，（M:100bpDNALadder，1 :10°，2: 10'3 :1〇-2,4 :1〇-3,5 :空白對照ddH20。
【具體實施方式】[0024] 實施例1
[0025] 具體的，本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種采用特異性引物快速鑒定南瓜實蠅的方法，其 具體步驟如下：
[0026] 采用試劑盒法提取南瓜實蠅基因組DNA。通過篩選獲得能特異性鑒定南瓜實蠅的 一對特異性引物，即NF404和NR610,特異性引物序列分別為：
[0027] NF404:5'TGCCTTAGCGATATTCTGGCT3' ；
[0028]NR610 :5'AACTGTGTTCAGCAGGTGGT3' ；
[0029] 利用核酸蛋白檢測儀測定DNA濃度檢測。
[0030] 一、SS-PCR引物的種特異性驗證：
[0031] 選用番石榴實蠅、桔小實蠅、顏帶實蠅、銹實蠅、瘤脛實蠅、楊桃實蠅、瓜實蠅、辣椒 實蠅、具條實蠅、近黑顏實蠅、黑膝實蠅、滇寡鬃實蠅、何氏華實蠅、棗實蠅、瓜棍腹實蠅、腿 端黑實蠅、黑顏實蠅作為陰性對照，南瓜實蠅為陽性對照，驗證南瓜實蠅特異性引物的種特 異性。SS-PCR在定量梯度PCR儀上進(jìn)行，反應(yīng)體系：2XEasyTaqPCRSuperMix12.5uL， 引物各luL，模板各2uL，加ddH20至總體積25uL;反應(yīng)條件為94°C/5min，94°C/40s， 62°C/30s，72°C/lmin，30個循環(huán)，最后延伸7min;分別提取5uLPCR產(chǎn)物在含DNA染色劑的 1. 5%的瓊脂糖凝膠多功能電泳儀上電泳30min(120V)，利用凝膠成像分析儀檢測是否擴增 出預(yù)期大小的目標(biāo)片段，拍攝并記錄結(jié)果。
[0032] 結(jié)果如圖1所示，僅南瓜實蠅在207bp處有一條特異性擴增的條帶，陰性對照均無 特異性目標(biāo)片段，從而證明該引物在實驗涉及的這些實蠅種類范圍內(nèi)，能特異性的鑒定南 瓜實蠅。
[0033] 二、SS-PCR引物對不同蟲態(tài)的擴增效果以及靈敏度檢測：
[0034] 分別以提取南瓜實蠅的卵、幼蟲、蛹和成蟲的DNA為模版，進(jìn)行靶標(biāo)片段擴增效果 檢驗。任取南瓜實蠅DNA模板，測的其濃度為57. 41ng/ul，按10_\ 10_2、10_3倍梯度稀釋，然 后使用種特異性引物NF404和NR610進(jìn)行PCR擴增，進(jìn)行最低檢出閾值的測定，SS-PCR方 法的檢測限度達(dá)57. 41X1(T2,最適模版DNA濃度為57. 41XKT1。如圖2、圖3所示，所篩選 的SS-PCR擴增引物的準(zhǔn)確性高，具有極佳的靈敏度。
【主權(quán)項】
1. 快速鑒定南瓜實蠅的SS-PCR特異性引物對，其特征在于包括： 引物NF404 :5'TGCCTTAGCGATAITCTGGCT3' ；和 引物NR610 :5'AACTGTGTTCAGCAGGTGGT3'。
2. 用于南瓜實蠅的快速鑒定的特異性基因片段，其特征在于，所述基因片段的核苷酸 序列如SEQIDNo:3所示。
3. -種南瓜實蠅特異性檢測方法，其特征在于，所述方法包括使用權(quán)利要求1所述 SS-PCR引物對進(jìn)行PCR擴增的步驟。
4. 一種南瓜實蠅檢測特異性檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括權(quán)利要求1所 述的南瓜實蠅特異性SS-PCR引物對。
【專利摘要】本發(fā)明涉及檢疫性害蟲檢測領(lǐng)域，快速鑒定南瓜實蠅的SS-PCR特異性引物對及試劑盒，包括引物NF404：TGCCTTAGCGATATTCTGGCT；和引物NR610：AACTGTGTTCAGCAGGTGGT。本發(fā)明所建立的SS-PCR快速鑒定南瓜實蠅的方法具有快速簡便、特異性高、靈敏度高等優(yōu)點，可以在8小時之內(nèi)完成南瓜實蠅的鑒定，能夠滿足口岸檢驗檢疫快速通關(guān)的要求。
【IPC分類】C12N15-11, C12Q1-68
【公開號】CN104711364
【申請?zhí)枴緾N201510149999
【發(fā)明人】郭瓊霞, 黃振, 婁定風(fēng), 林陽武, 沈建國, 陳韶萍
【申請人】福建出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心
【公開日】2015年6月17日
【申請日】2015年4月1日