化妝品用蚯蚓活性蛋白的提取方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別設(shè)及一種化妝品用祇蝴活性蛋白的提取方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著藥妝品工業(yè)的持續(xù)發(fā)展，研究和開發(fā)策略將更多地轉(zhuǎn)向醫(yī)藥類型的產(chǎn)品， 利用先進醫(yī)學(xué)技術(shù)的藥妝品已經(jīng)得到了快速發(fā)展，而且該一趨勢還將會更加強勁。目前， 美容手術(shù)包括微晶磨皮術(shù)和化學(xué)磨皮術(shù)、肉毒素護理和激光更新皮膚等，該些方法都能消 除不平滑的皮膚表面、老年斑和細小的皺紋，然而，大部分消費者更加青睞于使用化妝水 和枯皺精華等化妝品來美化肌膚。
[0003] 本研究所使用的祇蝴品種為赤子愛勝蝴，本品種在分類學(xué)上屬于正蝴科愛勝屬。 赤子愛勝蝴繁殖率高、適應(yīng)性強，很適合人工養(yǎng)殖，是目前世界上養(yǎng)殖最為普遍的一個品 種，其體內(nèi)的藥用成分也十分豐富，所W臨床上的制劑多W赤子愛勝蝴為原料。隨著生物技 術(shù)的發(fā)展，赤子愛勝蝴的藥用價值越來越多的被人們研究和關(guān)注。
[0004] 祇蝴的藥用價值與其體內(nèi)的活性物質(zhì)關(guān)系密切；實驗室前期的研究中發(fā)現(xiàn)祇蝴活 性蛋白提取物在動物水平上能夠促進燙傷創(chuàng)面的愈合，在細胞水平上能夠促進成纖維細胞 的增殖和遷移；但是，還未見從祇蝴中提取抗皺成分的資料，現(xiàn)有技術(shù)中祇蝴提取物提取工 藝還不是很完善，提取物中往往包含小分子成分的混合物、純度低；本發(fā)明的研究的主要任 務(wù)是科學(xué)提取出赤子愛勝蝴中促進成纖維細胞增殖的活性蛋白，并W其為原料研制出具有 抗皺活性的優(yōu)質(zhì)化妝品。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種化妝品用祇蝴活性蛋白的提取方法，通過該方法提取 的蟲丘蝴活性蛋白不含小分子雜質(zhì)，純度高，使用效果好。
[0006] 本發(fā)明的化妝品用祇蝴活性蛋白的提取方法，包括W下步驟： a、 取清洗干凈的鮮祇蝴，加入20mmol/L、抑為6. 8~7. 2的磯酸鹽緩沖液，冰浴條件下高 速勻漿，得到祇蝴勻漿液，并在4°C下靜置2~化，使蛋白充分溶出； b、 將祇蝴勻漿液分裝于離屯、管中，在4°C下，高速離屯、20~30min，取上清液；在室溫條 件下，加研細的硫酸錠進行鹽析，達到50%飽和度，使雜蛋白沉淀析出，得鹽析液； C、將鹽析液分裝于離屯、管中，在4°C下，高速離屯、20~30min，取上清液過0. 45化的膜， 取濾液； d、鹽析所述濾液采用0. 2化的中空纖維膜組件超濾的方式除去大分子物質(zhì)，然后用截 留分子量為20k-50k中空纖維膜組件超濾的方式脫鹽，最后冷凍干燥即得所述化妝品用蟲丘 蝴活性蛋白。
[0007] 本發(fā)明的有益效果是；本方法W新鮮的赤子愛勝蝴為原料，采用勻漿、離屯、、鹽析、 微濾、超濾、冷凍干燥等技術(shù)對其中的活性蛋白進行分離純化、采用NIH3T3成纖維細胞進 行活性跟蹤，獲得了具有較高增殖活性的祇蝴活性蛋白；在此基礎(chǔ)上，采用正交設(shè)計實驗考 察溶劑、料液比、溫度、提取時間四因素對活性蛋白提取的影響，通過不同鹽析濃度的研究 考察鹽析對祇蝴活性蛋白提取的影響，通過考察不同截留分子量中空纖維膜脫鹽的效果， 獲得的祇蝴活性蛋白不含小分子雜質(zhì)，純度高，使用效果好；為從祇蝴中提取具有促成纖維 細胞增殖活性的蛋白提供了實驗依據(jù)；將本發(fā)明方法制備的祇蝴活性蛋白應(yīng)用于化妝品， 具有使皮膚柔滑、補水保濕及延緩衰老的作用，可作為護膚品，直接用于皮膚。
【具體實施方式】
[0008] 下面將對本發(fā)明實施例中的方案進行清楚、完整的描述，基于本發(fā)明的實施例， 本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其它實施例，都屬于本發(fā) 明保護的范圍。
[000引實施例1; 取清洗干凈的鮮祇蝴500g，加入1000ml20mmol/L、抑7. 2的磯酸鹽緩沖液，用高速勻 漿機W220(K)巧m，冰浴條件下勻漿5min;將祇蝴勻漿液4°C靜置化，使蛋白充分溶出。
[0010] 將勻漿液分裝于離屯、管中，在4°C下，W15000巧m高速離屯、25min，取上清液。在 室溫條件下，加研細的硫酸錠進行鹽析，達到50%飽和度，使雜蛋白沉淀析出，此過程中要 不斷攬拌；硫酸錠須在30min內(nèi)加完，加完后繼續(xù)攬拌30min使硫酸錠充分溶解，4°C靜置 Ih，使雜蛋白充分沉淀。
[0011] 將鹽析液分裝于離屯、管中，在4°C下，W16500巧m離屯、28min，取上清液過0. 45化 的膜，取濾液。
[0012] 鹽析上清液采用0. 2化的中空纖維膜組件超濾的方式除去大分子物質(zhì)，然后用截 留分子量為20k-50k中空纖維膜組件超濾的方式脫鹽，最后冷凍干燥即得本發(fā)明的化妝品 用蟲丘蝴活性蛋白。
[001引實施例2; 取清洗干凈的鮮祇蝴500g，加入800ml20mmol/L、p冊.8的磯酸鹽緩沖液，用高速勻漿 機W180(K)巧m，冰浴條件下勻漿5min。將祇蝴勻漿液4°C靜置2.化，使蛋白充分溶出。
[0014] 將勻漿液分裝于離屯、管中，在4°C下，W15000巧m高速離屯、25min，取上清液。在 室溫條件下，加研細的硫酸錠進行鹽析，達到50%飽和度，使雜蛋白沉淀析出，此過程中要 不斷攬拌。硫酸錠須在30min內(nèi)加完，加完后繼續(xù)攬拌30min使硫酸錠充分溶解，4°C靜置 Ih，使雜蛋白充分沉淀。
[0015] 將鹽析液分裝于離屯、管中，在4°C下，W12000巧m離屯、30min，取上清液過0. 45化 的膜，取濾液。
[0016] 鹽析上清液采用0. 2化的中空纖維膜組件超濾的方式除去大分子物質(zhì)，然后用截 留分子量為20k-50k中空纖維膜組件超濾的方式脫鹽，最后冷凍干燥即得本發(fā)明的化妝品 用蟲丘蝴活性蛋白。
[0017] 實施例3; 采用祇蝴活性蛋白制備化妝水及其理化性質(zhì)的檢測： (1)化妝水的配方：甘油Ig;1%透明質(zhì)酸lOg;蘆芭膠Ig;海藻糖2g;水溶性維生素E0. 2g;杰馬0. 4g;蟲丘蝴活性蛋白5g;人參提取液5g;香精0.Olg;純凈水補足到lOOg。
[0018] (2)化妝水的制備方法為：按照W上配方精確稱量甘油，1%透明質(zhì)酸溶液，海藻 糖，水溶性維生素E及杰馬置燒杯中，玻璃椿攬勻后，加入5g人參提取液及5g祇蝴活性蛋 白提取液；繼續(xù)攬拌至均勻后加雙蒸水至lOOg，全部溶解后加入1滴香精對化妝品的香型 進行調(diào)節(jié)。
[0019] (3)檢測結(jié)果如表1所示；化妝水的抑為6. 8,在非陽光直射條件下觀察化妝水 的色澤，呈均勻透明的淺黃色，無雜質(zhì)；將化妝水擦于皮膚上，在室內(nèi)及非陽光直射條件下 觀察，結(jié)構(gòu)細膩，親和性較好；嗅覺辨別化妝水的香型，味道符合規(guī)定香型。在耐熱實驗中， 40°C保持2化后，恢復(fù)室溫后與試驗前無明顯的性狀差異。在耐寒實驗中，4°C保持2化后， 恢復(fù)室溫后與試驗前無明顯性狀差異。
【主權(quán)項】
1.化妝品用蚯蚓活性蛋白的提取方法，其特征是包括如下步驟： a、 取清洗干凈的鮮蚯蚓，加入20mmol/L、pH為6. 8~7. 2的磷酸鹽緩沖液，冰浴條件下高 速勻漿，得到蚯蚓勻漿液，并在4°C下靜置2~3h，使蛋白充分溶出； b、 將蚯蚓勻漿液分裝于離心管中，在4°C下，高速離心20~30min，取上清液；在室溫條 件下，加研細的硫酸按進行鹽析，達到50%飽和度，使雜蛋白沉淀析出，得鹽析液； c、 將鹽析液分裝于離心管中，在4°C下，高速離心20~30min，取上清液過0. 45Mm的膜， 取濾液； d、 鹽析所述濾液采用0. 2Mm的中空纖維膜組件超濾的方式除去大分子物質(zhì)，然后用截 留分子量為20k-50k中空纖維膜組件超濾的方式脫鹽，最后冷凍干燥即得所述化妝品用蚯 蚓活性蛋白。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種化妝品用蚯蚓活性蛋白的提取方法，包括以下步驟：取清洗干凈的鮮蚯蚓，加入磷酸鹽緩沖液，冰浴條件下高速勻漿，得到蚯蚓勻漿液；并分裝于離心管中，高速離心，取上清液；加研細的硫酸銨進行鹽析，使雜蛋白沉淀析出；將鹽析液分裝于離心管中，取上清液過0.45μm的膜，取濾液；采用超濾的方式除去大分子物質(zhì)，然后用截留分子量為20k-50k中空纖維膜組件超濾的方式脫鹽，最后冷凍干燥即得蚯蚓活性蛋白；本方法以新鮮的赤子愛勝蚓為原料，采用勻漿、離心、鹽析、微濾、超濾、冷凍干燥等技術(shù)對其中的活性蛋白進行分離純化獲得了具有較高增殖活性的蚯蚓活性蛋白，不含小分子雜質(zhì)，純度高，使用效果好。
【IPC分類】C07K1-36, C07K1-34, A61K8-64, A61Q19-00, C07K1-30, A61Q19-08
【公開號】CN104725466
【申請?zhí)枴緾N201510088980
【發(fā)明人】李振, 張勇, 單輝, 周海洋, 卞憲名, 葉素艷
【申請人】濟寧華能制藥廠有限公司
【公開日】2015年6月24日
【申請日】2015年2月27日