一種從蚯蚓中提取的sod的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及抗氧化酶領(lǐng)域，具體涉及一種從蚯蚓中提取的S0D。
【背景技術(shù)】
[0002]SOD(Superoxidedismutase)，中文名稱超氧化物歧化酶，是一類廣泛存在于生物 體內(nèi)的金屬酶，廣泛分布于動物、植物、微生物等各種生物體內(nèi)，它能催化超氧陰離子自由 基發(fā)生歧化反應(yīng)，從而能有效清除機(jī)體內(nèi)超氧陰離子自由基，是生物體重要的細(xì)胞防御系 統(tǒng)之一。S0D在生物體內(nèi)的水平高低意味著衰老與死亡的直觀指標(biāo)，現(xiàn)已證實(shí)，由氧自由基 引發(fā)的疾病多達(dá)60多種。S0D可對抗與阻斷因氧自由基對細(xì)胞造成的損害，并及時修復(fù)受 損細(xì)胞，復(fù)原因自由基造成的對細(xì)胞傷害，具有抗輻射、抗腫瘤及延緩機(jī)體衰老等功能，在 保健品、醫(yī)藥和化妝品行業(yè)中有重要的應(yīng)用價值。
[0003]S0D按其所含金屬輔基不同可分為三種，第一種含銅（Cu)鋅（Zn)金屬輔基（Cu， Zn-S0D)，是最為常見的一種S0D，呈綠色，主要存在于機(jī)體細(xì)胞漿中；第二種含錳（Mn)金屬 輔基（Mn-S0D)，呈紫色，存在于真核細(xì)胞的線粒體和原核細(xì)胞內(nèi)；第三種含鐵（Fe)金屬輔 基（Fe-SOD)，呈黃褐色，存在于原核細(xì)胞中。
[0004]目前，國內(nèi)外S0D多數(shù)來源于動物血液、肝臟，在我國有著豐富的資源，但隨著動 物疫病和血液安全性的問題日益突出，尋找一種合適的生物體并從中提取S0D的方法逐漸 受到本領(lǐng)域的廣泛關(guān)注。蚯蚓在我國傳統(tǒng)醫(yī)藥中有著悠久的應(yīng)用歷史，其中S0D酶活性高， 并且養(yǎng)殖成本低廉，安全性好。
[0005] 現(xiàn)有技術(shù)提供的從蚯蚓中提取S0D的工藝中，透析去鹽、丙酮沉淀仍是其中的關(guān) 鍵環(huán)節(jié)。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，透析工藝產(chǎn)能有限，過程耗時長，效率低；而作為有機(jī) 溶劑的丙酮，有著一定的毒性，不符合目前環(huán)保趨勢，并且丙酮在一定程度上還會引起蛋白 質(zhì)活性丟失。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明旨在克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，提供一種從蚯蚓中提取的高純度、高活性 的S0D;所述S0D以蚯蚓為原料，采用高效、安全、環(huán)保方法制備而成。
[0007] 本發(fā)明提供的S0D(超氧化物歧化酶）以蚯蚓作為提取原料，蚯蚓具有易于養(yǎng)殖、 來源廣泛、生物安全性高的特點(diǎn)；并且蚯蚓中S0D含量較高，是規(guī)?；a(chǎn)S0D的優(yōu)選原料。
[0008] 本發(fā)明提供了一種從蚯蚓中提取的S0D，所述S0D由包括以下步驟的方法制備而 成：
[0009] 1)將蚯蚓浸泡于濃度0. 1?5%的甲基纖維素溶液中，排凈沙土后，將蚯蚓清洗干 凈；
[0010] 2)將步驟1)所得蚯蚓浸泡于pH6. 7?6. 9的0. 045?0. 055mol/L磷酸鹽緩沖液 中，分散成勻漿液，離心后取上清，即得粗酶液；
[0011] 3)將硫酸銨加入步驟2)所得粗酶液中，靜置，離心后收集沉淀；
[0012] 4)將步驟3)所得沉淀溶解于pH6. 7?6. 9的0. 01?0. 02mol/L磷酸鹽緩沖液 中，將所得溶液加入平衡好的葡聚糖凝膠柱SephadexG-25頂端，用本步驟所述磷酸鹽緩沖 液進(jìn)行洗脫，收集含有蛋白質(zhì)且不含硫酸銨的洗脫液，濃縮，得濃縮液；
[0013] 5)在步驟4)所得濃縮液中加入NaCl，得到NaCl濃度為0. 4?0. 6mol/L的溶液， 將所得溶液加入平衡好的金屬螯合親和柱頂端，用pH值4. 1?4. 9的0. 015?0. 025mol/ L檸檬酸緩沖液進(jìn)行洗脫，收集含有蛋白質(zhì)的洗脫液，濃縮，冷凍干燥，即得SOD。
[0014] 本發(fā)明所述步驟1)中使用甲基纖維素溶液浸泡蚯蚓，甲基纖維素可以促進(jìn)蚯蚓 的腸道蠕動，可以高效、快速的清除蚯蚓體內(nèi)的沙土和廢物，大幅度縮短蚯蚓清洗、浸泡的 時間。具體的，所述甲基纖維素溶液的濃度優(yōu)選為0. 5?2% ;蚯蚓與甲基纖維素溶液的質(zhì) 量體積比為1 :1?10,優(yōu)選為1 :2?5,此處虹蚓的質(zhì)量單位為g，甲基纖維素溶液的體積 單位為ml;蚯蚓在甲基纖維素中浸泡的時間應(yīng)足以將其體內(nèi)沙土排除干凈，浸泡的時間優(yōu) 選為10?90min，進(jìn)一步優(yōu)選為30?60min;沙土排除干凈后，用清水將纟丘蝴通體清洗至少 三次，徹底將沙土、廢物和甲基纖維素溶液的殘留清洗干凈。
[0015] 本發(fā)明所述步驟2)中：所述磷酸鹽緩沖液為磷酸二氫鉀-磷酸氫二鉀緩沖液，該 緩沖液的濃度優(yōu)選為〇. 〇5mol/L，pH值優(yōu)選為6. 8 ;蚯蚓與磷酸鹽緩沖液的質(zhì)量體積比為1 : 1?20,優(yōu)選為1 :3?5,此處蚯蚓的質(zhì)量單位為g，磷酸鹽緩沖液的體積單位為ml;將蚯蚓 分散成勻漿液的設(shè)備選用常規(guī)的高速剪切機(jī)，高速剪切機(jī)的操作溫度為-5?20°C，優(yōu)選為 0?4°C，轉(zhuǎn)速為300?12000rpm，優(yōu)選為6000?8000rpm，剪切時間為0? 5?20min，優(yōu)選 為3?lOmin;所述離心的溫度為-5?20°C，優(yōu)選為0?4°C，離心速度為300?12000rpm， 優(yōu)選為1000?5000rpm，離心時間為0? 5?20min，優(yōu)選為5?15min。
[0016] 本發(fā)明所述步驟3)為硫酸銨分級沉淀法，具體為：將硫酸銨以質(zhì)量體積比0. 3? 〇. 5:1溶解于步驟2)所得粗酶液中，此處硫酸銨的質(zhì)量單位為g，粗酶液的體積單位為ml， 靜置20?40min，在0?4°C、7500?8500rpm條件下離心10?20min，分離上清液，收集沉 淀；在所得上清液中以質(zhì)量體積比0. 7?0. 9:1加入硫酸銨，此處硫酸銨的質(zhì)量單位為g， 上清液的體積單位為ml,靜置20?40min，在0?4°C、8500?9500rpm條件下離心25? 35min，收集沉淀；將兩次收集所得的沉淀合并。
[0017] 本發(fā)明所述步驟4)采用凝膠層析法除去硫酸銨，能快速獲得不含硫酸銨的蛋白 溶液，避免了常規(guī)透析除鹽方法的繁冗過程和可能造成的目標(biāo)產(chǎn)物損失。具體的，所述磷酸 鹽緩沖液為磷酸二氫鉀-磷酸氫二鉀緩沖液；緩沖液的濃度優(yōu)選為〇. 〇15mol/L，pH值優(yōu)選 為6. 8 ;步驟3)所得沉淀以質(zhì)量體積比1:1?5溶解于磷酸鹽緩沖液中，此處沉淀的質(zhì)量 單位為g，磷酸鹽緩沖液體積的單位為ml;葡聚糖凝膠柱選用SephadexG-25,凝膠柱的平 衡和流動相的洗脫均為常規(guī)操作；所述濃縮優(yōu)選為聚乙二醇濃縮法，所述聚乙二醇優(yōu)選為 PEG4000,濃縮步驟為常規(guī)操作。
[0018] 本發(fā)明所述步驟4)中，洗脫液中硫酸銨的鑒別方法具體為：取1滴洗脫液，滴在白 色比色盤孔中，加入1滴奈氏試劑混合，若出現(xiàn)棕黃色沉淀則表明洗脫液中含有硫酸銨。按 照上述標(biāo)準(zhǔn)，步驟4)收集的目標(biāo)洗脫液進(jìn)行該檢測后，不應(yīng)出現(xiàn)棕黃色沉淀。
[0019] 本發(fā)明所述步驟4)中，洗脫液中蛋白質(zhì)的鑒別方法具體為：取1滴洗脫液，滴在黑 色比色磁盤中，加入1滴20%磺基水楊酸混合，若出現(xiàn)白色絮狀沉淀則表明洗脫液中含有 蛋白質(zhì)。按照上述標(biāo)準(zhǔn)，步驟4)收集的目標(biāo)洗脫液進(jìn)行該檢測后，應(yīng)出現(xiàn)白色絮狀沉淀。
[0020] 本發(fā)明所述步驟5)中，金屬螯合親和柱所螯合的金屬離子選自銅、鋅、鐵、鎳離子 等常規(guī)的螯合用金屬離子；檸檬酸緩沖液的濃度優(yōu)選為〇. 〇2mol/L，pH值優(yōu)選為4. 5 ;洗脫 液中蛋白質(zhì)的鑒別方法與步驟4)相同；所述濃縮優(yōu)選為聚乙二醇濃縮法，所述聚乙二醇優(yōu) 選為PEG4000,濃縮步驟為常規(guī)操作。該步驟通過金屬親和層析法進(jìn)行蛋白純化，能夠快速 獲得純化后的S0D，能夠避免S0D的活性損失，且安全性更高，更環(huán)保。
[0021] 作為本發(fā)明的最優(yōu)選方案，所述S0D由包括以下步驟的方法制備而成：
[0022] 1)將蚯蚓以重量體積比1 :2浸泡于濃度0. 5%的甲基纖維素溶液中60min，排凈 沙土后，將蚯蚓清洗干凈；
[0023] 2)將步驟1)所得蚯蚓以質(zhì)量體積比為1 :3浸泡于冰浴后的pH6. 8、0. 05mol/L 磷酸二氫鉀-磷酸氫二鉀緩沖液中，用高速剪切機(jī)將蚯蚓分散成勻漿液，操作條件為〇°c、 3000rpm、lOmin;在0°C、3000rpm條件下離心15min，取上清，即得粗酶液；
[0024] 3)將硫酸銨以質(zhì)量體積比0.4:1溶解于步驟2)所得粗酶液中，靜置30min，在 0°C、8000rpm條件