一種抗小反芻獸特異性IgY的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種抗小反芻獸特異性IgY的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]小反合獸疫(Peste des petits nlrninants，PPR)俗稱羊瘟，又名小反合獸假性牛瘟(pseudorinderpest)、肺腸炎(pneumoenteritis)、口炎肺腸炎復(fù)合癥(stomatitis-pneumoenteritis complex)，是A類烈性傳染病，是由小反合獸疫病毒引起的一種嚴(yán)重的烈性、接觸性傳染病，主要感染小反芻動物，以發(fā)熱、口炎、腹瀉、肺炎為特征。主要感染小反芻獸，特別是山羊高度易感。
[0003]目前對PPR尚元特效的治療方法。對于發(fā)病的動物使用抗生素和磺氨類藥物對癥治療可以防止細(xì)菌的繼發(fā)感染。用高免血清進行被動免疫在疫病發(fā)生時減少疫病的傳播，但是對已經(jīng)發(fā)病的病畜無作用。目前防制PPR，主要是依賴于疫苗的免疫接種，耐過PPR的綿羊和山羊會產(chǎn)生主動免疫。根據(jù)PPH病毒和RP病毒的抗原相關(guān)性，可用RP組織培養(yǎng)疫苗來對綿羊和山羊進行PPR免疫。Bourdin等首次報道使用細(xì)胞培養(yǎng)的RP弱毒疫苗免疫山羊防制PPR，產(chǎn)生的抗RP抗體能夠抵抗PPR病的攻擊，而且對于新生羔羊和懷孕母羊無致病性，具有良好的保護作用，西非某些地區(qū)用此成功地控制了 PPR。Ndulaka等用感染山羊的病理組織制備同源的PPR滅活疫苗，用甲醛滅活制備的效果不佳，而用氯仿滅活制備的疫苗，其有效期4°C可保護I年，免疫山羊后血清抗體可以持續(xù)8個月。Jones L等用基因重組技術(shù)，成功的同時表達(dá)了 RPV的F基因和H基因制備了重組疫苗免疫山羊。雖然產(chǎn)生的是抗RPV的抗體(中和抗體和ELISA抗體)，無抗PPRV的抗體，但用PPR病毒攻擊，全部獲得保護。同時也提示了可能是由于存在細(xì)胞免疫，重組的H蛋白產(chǎn)生抗RPV的中和抗體，而表達(dá)的F蛋白無抗體產(chǎn)生，二者都無抗PPRV的抗體產(chǎn)生。
[0004]為了克服應(yīng)用牛瘟疫苗預(yù)防PPR影響對RP血清監(jiān)控的問題，同時也為了使制備RP疫苗對PPR更有效，研宄者應(yīng)用反向遺傳技術(shù)制備RPV/PPRV嵌臺體疫苗，應(yīng)用PPRV的糖蛋白基因替代RPV疫苗表面相應(yīng)的糖蛋白基因。這種嵌合體疫苗對PPRV產(chǎn)生良好的免疫原性，并且免疫動物血清中無特異的RP病毒ELISA抗體。研宄小組目前正在構(gòu)建3種嵌合體疫苗，用PPRV的F蛋白和H蛋白分別單獨或二者同時替代RPV疫苗基因組中的相應(yīng)蛋白，期望這種疫苗能與自然感染RPV或PPRV產(chǎn)生的抗體和區(qū)別，這將有助于對野外存在的這兩種疫病進行血清學(xué)監(jiān)控。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種抗小反芻獸特異性IgY的制備方法，以便用于小反芻獸疫病檢測與治療。
[0006]本發(fā)明具體通過以下技術(shù)方案實現(xiàn):
[0007]一種抗小反芻獸特異性IgY的制備方法，通過以下步驟完成:
[0008]I)量取小反芻獸疫病毒滅活苗，加入等體積的免疫佐劑，選取生產(chǎn)狀態(tài)良好的70?80日齡未開產(chǎn)母雞進行免疫；
[0009]2)收集雞蛋進行消毒，4°C冰箱存儲不多于45天，使用苯扎溴銨溶液進行表面清洗，烘干后收集卵黃，將卵黃使用無菌NaCl溶液進行稀釋；
[0010]3)向稀釋液加入PEG-6000，充分?jǐn)嚢?，搖床上室溫作用20?30分鐘；
[0011]4)離心分離，收集上清，過濾，濾液加入PEG-6000，充分?jǐn)嚢?，搖床上室溫作用20?30分鐘；
[0012]5)離心分離，棄去上清液，沉淀使用1mL的無菌溶液NaCl溶液懸浮，加入PEG-6000，充分?jǐn)嚢瑁瑩u床上室溫作用20?30分鐘，進行離心，獲得沉淀物；
[0013]6)將沉淀物使用1.2?1.5mlNaCl溶液溶解，使用透析帶進行透析，收集IgY，并保存在_20°C備用。
[0014]所述的免疫佐劑由氫氧化鋁和蜂膠組成，氫氧化鋁和蜂膠組成的重量比為4?9:1。
[0015]步驟(I)中免疫方法為免疫注射，分為胸肌、腿肌各兩點肌注免疫，初次免疫30天之后，進行4次加強免疫，間隔時間為15?30天，免疫劑量為200?1000 μ g/kg。
[0016]所述的苯扎溴銨溶液的質(zhì)量濃度為10?50g/L。
[0017]所述的卵黃與NaCl溶液的體積比為1:1?4。
[0018]步驟(3)中所述的PEG-6000與稀釋液的質(zhì)量體積比為25?50g/L。
[0019]步驟(4)中所述的PEG-6000與濾液的質(zhì)量體積比為60?90g/L。
[0020]步驟(5)中所述的PEG-6000與懸浮液的質(zhì)量體積比為100?130g/L。
[0021]步驟(6)中透析具體方法為使用I X PBS (pH = 7.2?7.5)透析過夜，次日凌晨換用 0.5 X PBS (pH = 7.4)，12 ?14h 后，用 0.1 X PBS (pH = 7.0)透析 6 ?1h0
[0022]本發(fā)明所屬的NaCl溶液質(zhì)量濃度為500?900g/L。
[0023]本發(fā)明所述的IgY抗體經(jīng)包含兩條鏈，重鏈為65ku和輕鏈為19ku。
[0024]本發(fā)明的有益效果為:本發(fā)明提取的抗E2_IgY抗體可較好地結(jié)合E2蛋白，而與降解片段無交叉反應(yīng)；提取方法相對簡單，抗體產(chǎn)量大，制備成本低。
【具體實施方式】
[0025]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步的說明，以下所述，僅是對本發(fā)明的較佳實施例而已，并非對本發(fā)明做其他形式的限制，任何熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員可能利用上述揭示的技術(shù)內(nèi)容加以變更為同等變化的等效實施例。凡是未脫離本發(fā)明方案內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實質(zhì)對以下實施例所做的任何簡單修改或等同變化，均落在本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。
[0026]實施例1
[0027]一種抗小反芻獸疫病毒特異性IgY的制備方法，所述方法包括以下步驟:
[0028]1、免疫原制備及免疫
[0029]量取小反芻獸疫病毒滅活苗溶液，加入等體積的免疫佐劑(氫氧化鋁:蜂膠=4?9:1)，進行乳化，待其形成良好的油包水型，選取生產(chǎn)狀態(tài)良好的80日齡未開產(chǎn)母雞5只，進行初次免疫注射，免疫劑量為200?1000 μ g/kg，分為胸肌、腿肌左右各兩點肌注免疫，初次免疫30天之后，進行4次加強免疫，間隔時間為15?30天，免疫劑量為200?1000 μ g/kg,最后一次使用弗氏不完全佐劑進行加強免疫。待母雞開產(chǎn)后，收集免疫雞蛋，新潔爾滅消毒，標(biāo)號，4°C保存(不多于45天)。
[0030]2、IgY抗體提取與鑒定
[0031]改良的聚乙二醇(PEG-6000)沉淀法提取IgY抗體，操作步驟如下:
[0032]I)將所述收集的蛋，使用新潔爾滅(0.01?0.05W/V)進行表面清洗，烘干后分離器分離卵黃與蛋清；
[0033]2)卵黃和無菌生理鹽水(NaCl 0.5?0.9W/V)緩沖液1:4混合，渦旋，充分混勻；
[0034]3)加入3.5% (W/V，下同)的PEG-6000，渦旋混合，搖床上室溫作用10?30min ；
[0035]4)離心(10000rpm，4°C，20min，下同)后，出現(xiàn)分層，由上而下為黃色脂肪層、清亮層(IgY)和半固體層;
[0036]5)液體經(jīng)濾紙過濾，棄去沉淀物，記錄所得濾液體積，加6 %?9 % PEG-6000，搖床上室溫作用10?30min ；
[0037]6)離心，如上，棄去上清液，沉淀物加1ml NaCl (0.5?0.9W/V)溶解，加12%(1.2g)PEG 6000，在搖床上室溫作用10?30min ；
[0038]7)離心，如上，棄去上清液，沉淀物加1.2ml NaCl溶解；
[0039]8)將所述沉淀物使用1.2?1.5毫升NaCl (0.5?0.9W/V)溶解后，使用透析帶進行透析，使用I XPBS (pH =