用于檢測小反芻獸疫病毒血凝素蛋白抗體的試劑盒及其使用方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及用于檢測小反芻獸疫病毒血凝素蛋白抗體的試劑盒及其使用方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 小反芻獸疫是我國農(nóng)業(yè)部制定的《法定動物疫病病種名錄》中規(guī)定的I類動物疫 病。在周邊國家相繼發(fā)生此病后，自然的地理屏障一喜馬拉雅山脈最終被突破，2007年該疫 病在我國西藏發(fā)生，對我國動物衛(wèi)生安全造成了嚴(yán)重威脅。
[0003] 自2007年我國確診在西藏阿里地區(qū)暴發(fā)了一起山羊小反芻獸疫疫情后，到目前 為止，我國新疆、甘肅、內(nèi)蒙、貴州等20多個省區(qū)發(fā)生了小反芻獸疫疫情。小反芻獸疫危害 著我國西部地區(qū)養(yǎng)羊業(yè)的發(fā)展，因此對疫情的監(jiān)視和控制是防止小反芻獸疫進(jìn)一步擴散首 要的任務(wù)。
[0004] 麻疹病毒屬的病毒都是親淋巴細(xì)胞性，可使各自宿主發(fā)生災(zāi)難性疾病，伴隨有嚴(yán) 重的淋巴細(xì)胞減少和免疫抑制。病毒與宿主易感細(xì)胞上的特異性受體分子相結(jié)合而啟動其 復(fù)制過程，是病毒進(jìn)入細(xì)胞的第一步，是病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞的"核心"機制。H糖蛋白的主要 作用是與宿主細(xì)胞膜受體結(jié)合，并調(diào)節(jié)病毒的吸附及入侵宿主細(xì)胞。同時，H蛋白也是病毒 的主要抗原成份和引起宿主細(xì)胞病變（CPE)的決定因素。
[0005] 近年來，國內(nèi)外學(xué)者利用多種表達(dá)體系對H蛋白的表達(dá)和功能進(jìn)行了研究，該蛋 白可在多種表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)，但由于編碼基因自身特征，表達(dá)量均不高。在表達(dá)系統(tǒng)中， 原核系統(tǒng)如E. coli比哺乳動物細(xì)胞和昆蟲表達(dá)系統(tǒng)更為經(jīng)濟，也因為其簡單、容易大批生 產(chǎn)以及不用翻譯后修飾而被廣泛使用。此外，現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)去除胞內(nèi)區(qū)域的截短H蛋白 (truncated H protein)仍具有正常的與細(xì)胞受體結(jié)合的能力。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明提供了用于檢測小反芻獸疫病毒血凝素蛋白抗體的試劑盒及其使用方法。
[0007] 本發(fā)明提供一對用于擴增小反芻獸疫病毒血凝素蛋白（H蛋白)胞外區(qū)基因的特異 性引物，所述特異性引物為： 上游引物：5'GGGATCCATGAGGCTTCACCGAGCCACC3' ； 下游引物：5，CCAAGCTTCTAGACTGGATTACATGTTACCTC3'。
[0008] 本發(fā)明提供一種用于檢測小反芻獸疫病毒血凝素蛋白（H蛋白）抗體的試劑盒，所 述試劑盒以小反芻獸疫病毒血凝素蛋白基因胞外區(qū)序列編碼的重組蛋白為包被抗原。
[0009] 優(yōu)選地，所述重組蛋白的制備方法為：將小反芻獸疫病毒血凝素蛋白基因胞外區(qū) 序列擴增后克隆至pET_30a(+)表達(dá)載體的多克隆位點處，獲得重組表達(dá)質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒 轉(zhuǎn)入宿主感受態(tài)細(xì)胞中，在IPTG誘導(dǎo)下表達(dá)，純化后得到重組蛋白。
[0010] 更進(jìn)一步地，所述重組蛋白的制備方法為：（1)合成引物，上游引物：5'GGGATCCAT GAGGCTTCACCGAGCCACC3'，下游引物：5' CCAAGCTTCTAGACTGG ATTACATGTTACCTC3' ；（2)通過 RT-PCR方法從小反芻獸疫病毒RNA中獲得長度為1653bp的片段，將該片段構(gòu)建到原核表 達(dá)載體pET-30a(+)中得重組質(zhì)粒pET-30a(+)-tH ; (3)將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL-21宿主菌，用 IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，純化得到重組蛋白。
[0011] 優(yōu)選地，所述重組蛋白的氨基酸序列參見SEQ ID No. 2。
[0012] 優(yōu)選地，所述試劑盒還包括酶標(biāo)二抗，所述酶標(biāo)二抗為鼠抗羊酶標(biāo)二抗，所述酶為 辣根過氧化物酶；優(yōu)選地，所述酶標(biāo)二抗的稀釋度為1:30000。
[0013] 優(yōu)選地，所述試劑盒中包被抗原的包被量為I. 0 μ g/孔。
[0014] 本發(fā)明的第二個目的是提供上述試劑盒的使用方法，步驟如下： (1) 包被酶標(biāo)板：用純化后的重組蛋白包被酶標(biāo)板，洗滌； (2) 封閉酶標(biāo)板，洗滌；封閉劑優(yōu)選含有5%脫脂奶粉的PBST ; (3) 加入待檢血清，反應(yīng)后洗滌；優(yōu)選地，稀釋倍數(shù)為1:80 ; (4) 加入酶標(biāo)二抗，反應(yīng)后洗滌；所述酶標(biāo)二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記的鼠抗羊酶標(biāo)二 抗；優(yōu)選地，稀釋倍數(shù)為1:30000倍； (5) 顯色，終止，在酶標(biāo)儀上讀取漢?45。的光吸收值； (6) 結(jié)果判定：當(dāng)待檢血清的嫩45。值多0. 57時，則判為陽性；當(dāng)待檢血清的嫩45。值 < 0. 47時，則判為陰性；當(dāng)0. 47彡待檢血清的漢)45。值< 0. 57時，為可疑陰性。
[0015] 本發(fā)明的第三個目的是提供小反芻獸疫病毒血凝素蛋白基因胞外區(qū)序列編碼的 重組蛋白在檢測小反芻獸疫病毒中的應(yīng)用，所述應(yīng)用不以活的人體或動物體及其離體樣品 為檢測對象。
[0016] 優(yōu)選地，所述重組蛋白的氨基酸序列參見SEQ ID No. 2。
[0017] 本發(fā)明的第四個目的是提供小反芻獸疫病毒血凝素蛋白（H蛋白）抗體的檢測方 法，步驟如下： (1) 包被酶標(biāo)板：用純化后的重組蛋白包被酶標(biāo)板，洗滌； (2) 封閉酶標(biāo)板，洗滌；封閉劑優(yōu)選含有5%脫脂奶粉的PBST ; (3) 加入待檢血清，反應(yīng)后洗滌；優(yōu)選地，稀釋倍數(shù)為1:80 ; (4) 加入酶標(biāo)二抗，反應(yīng)后洗滌；所述酶標(biāo)二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記的鼠抗羊酶標(biāo)二 抗；優(yōu)選地，稀釋倍數(shù)為1:30000倍； (5) 顯色，終止，在酶標(biāo)儀上讀取漢?45。的光吸收值； (6) 結(jié)果判定：當(dāng)待檢血清的嫩45。值多0. 57時，則判為陽性；當(dāng)待檢血清的嫩45。值 < 0. 47時，則判為陰性；當(dāng)0. 47彡待檢血清的漢)45。值< 0. 57時，為可疑陰性。
[0018] 應(yīng)用本發(fā)明的方法能夠快速而特異地檢測血清中小反芻獸疫病毒H蛋白抗體，反 應(yīng)特異性好，靈敏度高，其操作簡單、成本低廉，反應(yīng)結(jié)果穩(wěn)定可靠、易于觀察，非常適用于 小反芻獸疫的進(jìn)出口檢疫、食品衛(wèi)生以及畜牧飼養(yǎng)場的大批樣品的篩查，易于大范圍推廣 應(yīng)用。與OIE推薦的"小反芻獸疫競爭ELISA試劑盒（PPR competitive ELISA kit) "(BDSL 公司，Biological Diagnostic Supplies Ltd, France)的對比檢測符合率為 96. 4%〇
【具體實施方式】
[0019] 以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自 常規(guī)生化試劑商店購買得到的。
[0020] 實施例1 一、小反芻獸疫病毒（PPRV)血凝素蛋白（H)胞外區(qū)重組蛋白（tH蛋白）的制備 1、引物設(shè)計 根據(jù)GenBank登載的PPRV Nigeria 75/1株序列（登錄號：X74443)中H基因胞外區(qū) (tH)序列設(shè)計引物。
[0021] h游引物：5' GGGATCCATGAGGCTTCACCGAGCCACC3' ； 下游引物：5' CCAAGCTTCTAGACTGGATTACATGTTACCTC3'。
[0022] 其中，劃橫線部分分別為及_^1和III酶切位點。
[0023] 2、RT-PCR 擴增 (1) 提取小反芻獸疫疫苗株Nigeria 75/1細(xì)胞毒RNA ; (2) RT-PCR擴增，獲得tH片段（1653Βρ)3Η片段的核苷酸序列見序列表SEQ ID No. 1。
[0024] 具體反應(yīng)體系及反應(yīng)條件為：反應(yīng)體系：25 μ 1總體系中總RNA0. 5 μ g， 5XbufTer5yl，10mmol/LdNTP0.5yl，DTT1.25yl，弓丨物（上游 + 下游）2μ1，酶（mix) 0·5μl，剩余為DEPC水。反應(yīng)條件：95°C預(yù)熱變性5min;94°C，lmin ;53°C，lmin;72°C， 100s，35 個循環(huán)，72Γ，IOmin ;4Γ，30min。
[0025] (3)將擴增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，在1653bp左右處出現(xiàn)一條特異電泳條帶， 與預(yù)期的大小一致。
[0026] (4 )將擴增產(chǎn)物連接到原核表達(dá)載體pET_30a (+)中，取用及油"1和份 III pET-30a (+)雙酶切的 pET-30a (+)載體 1 μ L (50 μ g/ μ L)與上述 RT-PCR 片段 3 μ L 混 合后，加入 2XRapid ligase buffer 5yL，T^NA 連接酶 IyL (3u/yL)，混勻后置 4°C 連 接過夜，得到重組質(zhì)粒pET-30a (+)-tH。
[0027] (5)將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至A cWi BL21感受態(tài)細(xì)胞，用含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基篩 選；用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，并優(yōu)化、確定蛋白的最佳表達(dá)條件。該重組蛋白的氨基酸序列參見序 列表 SEQ ID No. 2。
[0028] 灰度掃描分析發(fā)現(xiàn)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的重組基因工程菌獲得表達(dá)，產(chǎn)生分子量大小約 為60kDa的特異性蛋白條帶，重組tH蛋白主要以包涵體形式表達(dá)。通過改變誘導(dǎo)溫度、誘 導(dǎo)時間和IPTG濃度來增加重組tH蛋白的表達(dá)量，SDS-PAGE分析顯示，按1 %比例接入二 級種子液，3