一種吸收苯的青蒿的培育方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及利用基因工程培育植物領(lǐng)域，具體是一種利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育可以吸 收苯的青蒿的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 家居裝飾在人們?nèi)粘Ｉ钪斜夭豢缮?，裝飾材料中存在著各種化工原料，化工合 成材料越來(lái)越多地用于家居裝修材料，尤其是使用質(zhì)量差的裝飾和裝修材料，室內(nèi)污染更 嚴(yán)重，裝修后的新房釋放的化學(xué)污染成為很嚴(yán)重的問(wèn)題，給人們健康帶來(lái)潛在的危害。室內(nèi) 家居環(huán)境污染引起了廣泛的關(guān)注與研宄，四個(gè)全球性環(huán)境問(wèn)題之一就是室內(nèi)環(huán)境污染。室 內(nèi)裝修污染可以引起支氣管炎和肺癌慢性肺病呼吸道疾病，有研宄表明兒童白血病與家居 裝修后釋放的化學(xué)物質(zhì)有一定相關(guān)性。所謂的室內(nèi)環(huán)境是指人們工作生活活動(dòng)所處的相對(duì) 封閉的室內(nèi)空間，指辦公室和家居住房等室內(nèi)活動(dòng)場(chǎng)所。裝修過(guò)程以及完工過(guò)后釋放的污 染物質(zhì)主要有苯、甲醛、氨和氡輻射等。
[0003] 苯具有特殊芳香味、無(wú)色，是易揮發(fā)的環(huán)芳香烴類化合物，包括苯、甲苯、乙苯、鄰、 間、對(duì)二甲苯等，已被發(fā)達(dá)國(guó)家列為優(yōu)先控制污染物。由于各種建筑材料大量使用苯，是家 居裝修中主要的揮發(fā)性物質(zhì)之一。長(zhǎng)時(shí)間吸入苯會(huì)引起慢性苯中毒，其原因是中樞神經(jīng)系 統(tǒng)受到抑制。裝修中釋放的苯，含有苯及甲苯和二甲苯，主要來(lái)源于家具中使用的一些油 漆、膠、溶劑、涂料、粘合劑、墻紙等。許多專家將苯列為家居裝修中的致癌物質(zhì)之一。長(zhǎng)期 接觸苯會(huì)引起遺傳毒性致瘸性、血液毒性、表現(xiàn)為胸悶、頭暈嘔吐、惡心，嗜睡、引發(fā)貧血和 中樞神經(jīng)視線模糊、血液病，出現(xiàn)皮膚過(guò)敏性濕瘆，支氣管炎，喉頭水腫及血小板下降等；婦 女妊娠貧血和嘔吐，流產(chǎn)，胎兒先天性畸形缺陷等。慢性苯中毒可以使骨髓造血機(jī)能發(fā)生障 礙，引起再生障礙性貧血，研宄表明白血病也與家居裝修釋放的苯有一定關(guān)聯(lián)。
[0004] 微生物能部分降解苯，苯降解菌主要有假單胞菌、不動(dòng)桿菌、芽孢桿菌、紅球菌、諾 卡氏菌、羅爾斯通氏菌、產(chǎn)堿桿菌等。在苯的降解過(guò)程中，細(xì)菌首先氧化芳香烴化合物，最初 通過(guò)酶的催化作用將空氣中的氧引入到底物中，環(huán)羥基化加雙氧酶（Ring hydroxylation dioxygenase, Rhd)催化起始反應(yīng)是苯生物降解過(guò)程的限速步驟，苯系物加雙氧酶是降解過(guò) 程中的關(guān)鍵酶，加雙氧酶是在苯環(huán)上直接加二個(gè)氧原子形成兒茶酚；加單氧酶則直接攻擊 苯環(huán)或者氧化側(cè)鏈，進(jìn)而生成鄰苯二酚，再經(jīng)過(guò)鄰苯二酚雙加氧酶作用使苯環(huán)裂解，生成醛 或者酸，醛或酸再通過(guò)三羧酸循環(huán)氧化分解成CO 2和水。苯的芳香環(huán)斷裂后可以生成丙酮 酸、琥珀酸、乙酸、延胡索酸和乙醛，這些物質(zhì)均能被微生物利用，為其提供能量和合成細(xì)胞 結(jié)構(gòu)分子。苯系物的芳香環(huán)第一個(gè)環(huán)裂解后（即分解成〇) 2和丙酮酸），第二個(gè)環(huán)也會(huì)受到 同上的攻擊從而進(jìn)入降解過(guò)程。
[0005] 室內(nèi)裝修揮發(fā)釋放到空氣中的苯類化合物，通過(guò)氣孔和皮孔擴(kuò)散到植物組織中， 進(jìn)入植物細(xì)胞內(nèi)，與細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞器內(nèi)的相關(guān)酶發(fā)生反應(yīng)，可以將苯轉(zhuǎn)化成其它物質(zhì)，最終 以二氧化碳和水的形式被釋放出來(lái)。青蒿中的藥用成分可分為揮發(fā)性和非揮發(fā)性2個(gè)部 分。青蒿（Artemisia annual L )中化學(xué)成分分含有：黃酮、倍半貓、香豆素和揮發(fā)油。非 揮發(fā)性成分主要是青蒿素。揮發(fā)性成分主要為揮發(fā)油，包括異篙酮、篙酮、左旋樟腦、按油 精、龍腦、旅烯、倍半褚醇、丁香烯、石竹烯氧化物等成分.其中丁香烯、篙酮、異篙酮、樟腦、 龍腦等活性較高，青蒿植株高大，氣味芳香，放置于新修小區(qū)或者新裝修的房子內(nèi)，可以壓 制或者清除異味，青蒿揮發(fā)成分如烯、酮、醇類等化學(xué)物質(zhì)彌漫在空氣中，能消耗掉空氣中 部分有害化學(xué)物質(zhì)苯，達(dá)到清除的目的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 針對(duì)現(xiàn)有家居裝修中苯的釋放，人們對(duì)清除空氣中苯污染的家居植物需求，而培 育的環(huán)羥基化加雙氧酶超表達(dá)轉(zhuǎn)基因青蒿。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是在青蒿基因組中 導(dǎo)入能增加環(huán)羥基化加雙氧酶合成的基因，并增強(qiáng)其原有基因的表達(dá)，獲得轉(zhuǎn)基因青蒿新 品系，以提高其環(huán)羥基化加雙氧酶合成能力，使其葉片中能超量轉(zhuǎn)化吸入葉片細(xì)胞內(nèi)苯的 目的，使這種轉(zhuǎn)基因青蒿品系成為清除家居裝修中釋放的苯的清除植物。
[0007] 環(huán)羥基化加雙氧酶是生物體內(nèi)清除苯的關(guān)鍵性酶，增強(qiáng)Rhd基因活性，可以提高 青蒿植株環(huán)羥基化加雙氧酶的活性，本發(fā)明將芽孢桿菌屬（Bacillus)環(huán)羥基化加雙氧酶 基因 Rhd基因克隆轉(zhuǎn)化導(dǎo)入青蒿，提高青蒿中的環(huán)羥基化加雙氧酶合成，獲得高環(huán)羥基化 加雙氧酶活性的基因工程青蒿品種，為培育環(huán)羥基化加雙氧酶高活性的青蒿提供一種新的 方法。本發(fā)明旨在構(gòu)建Rhd基因的植物表達(dá)載體，并獲得重組工程青蒿植株，利用轉(zhuǎn)基因 技術(shù)培育環(huán)羥基化加雙氧酶高活性的青蒿奠定基礎(chǔ)。
[0008] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是，一種吸收苯的青蒿的培 育方法，包括如下步驟：
[0009] 1)克隆菌株芽孢桿菌屬環(huán)羥基化加雙氧酶的基因片段，記為Rhd基因片段，并將 Rhd基因片段構(gòu)建成重組質(zhì)粒pCB-Rhd ;
[0010] 2)利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將重組質(zhì)粒pCB-Rhd基因?qū)肭噍?，獲得包含Rhd基因的青蒿 植株；采用電擊法將PCB-Rhd導(dǎo)入農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞EHA105,然后采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將所 述農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞EHA105導(dǎo)入青蒿，構(gòu)成包含Rhd基因的青蒿植株。
[0011] 具體地，在本發(fā)明中所述Rhd基因的DNA序列為SEQ ID NO. 1。
[0012] 通過(guò)對(duì)青蒿基因組進(jìn)行的上述改造，可大幅度提高青蒿吸收苯的能力，使之成為 清除家居裝修中釋放的苯的植物。
[0013] 本發(fā)明用于作為Rhd基因受體親本的青蒿是同一品種。在青蒿中導(dǎo)入Rhd基因可 以提高青蒿吸收苯的能力，在密閉苯熏蒸室內(nèi)，普通植株苯吸收為〇. 12mg/m2. h時(shí)，本發(fā)明 得到的轉(zhuǎn)基因青篙植株苯吸收最高為〇. 23mg/m2. h，其苯吸收是非轉(zhuǎn)化對(duì)照青篙活性的近2 倍。本發(fā)明的方法對(duì)于清除家居裝修中釋放的苯具有重要意義（如圖5)。
[0014] 圖1為用pET28a_Rhd轉(zhuǎn)化大腸桿菌Ecoli DH5a感受態(tài)細(xì)胞，重組子單菌落培養(yǎng) 后，重新提取質(zhì)粒酶切鑒定及測(cè)序后，再轉(zhuǎn)化到表達(dá)宿主菌BL21(DE3)中進(jìn)行蛋白表達(dá)，不 同IPTG濃度（異丙基-β-D-硫代半乳糖苷）刺激重組蛋白進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)的PCR擴(kuò)增圖；
[0015] 圖中M標(biāo)示Marker, 1為對(duì)照Vector, 2、3、4、5、6為不同IPTG濃度（其中濃度分 別為 0· 01mmol/L, 0. 05mmol/L, lmmol/L, I. 5 mmol/L, 2. Ommol/L, 2. 5mmol/L)誘導(dǎo)表達(dá)的蛋 白質(zhì) SDS-PAGE。
[0016] 圖2植物表達(dá)載體結(jié)構(gòu)圖；
[0017] 圖中為pCAMBIA2301_Rhd載體構(gòu)建示意圖，在目的基因前面加上酶蛋白啟動(dòng)子或 者酶啟動(dòng)子在目的基因后面加上終止子。
[0018] 圖3為候選轉(zhuǎn)基因植株的PCR特異性擴(kuò)增結(jié)果示意圖；
[0019] 圖中M標(biāo)示Marker, V為僅轉(zhuǎn)染Vector，1、2、3、4、5、6泳道為不同候選陽(yáng)性植株， 即轉(zhuǎn)染Rhd基因的陽(yáng)性植株。
[0020] 圖4為候選轉(zhuǎn)基因植株的實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)結(jié)果；
[0021] 其中，縱坐標(biāo)表示轉(zhuǎn)錄水平，Vector表示對(duì)照植株，Rhd表示候選轉(zhuǎn)基因植株。
[0022] 圖5為在密閉苯熏蒸室內(nèi)，陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株與對(duì)照植株葉片對(duì)苯的吸收能力的數(shù) 據(jù)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)圖，圖中，Vector表示對(duì)照，Rhd表示候選轉(zhuǎn)基因植株。
[0023] 圖4和圖5中"Rhd_"后的阿拉伯?dāng)?shù)字表示不同轉(zhuǎn)基因植株的編號(hào)。
【具體實(shí)施方式】
[0024] 下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，但不應(yīng)該理解為本發(fā)明上述主題 范圍僅限于下述實(shí)施例。在不脫離本發(fā)明上述技術(shù)思想的情況下，根據(jù)本領(lǐng)域普通技術(shù)知 識(shí)和慣用手段，做出各種替換和變更，均應(yīng)包括在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0025] 材料：采用常規(guī)野生青蒿，2008年來(lái)源于重慶秀山縣，在重慶醫(yī)藥高等專科學(xué)校 以常規(guī)種植了 5代。
[0026] 菌株：菌株芽孢桿菌屬（Bacillus)為本實(shí)驗(yàn)室從某家具廠廢物廢水中分離得到， 大腸桿菌Ecoli DH5a感受態(tài)（感受態(tài)細(xì)胞制備采取CaClJi )，農(nóng)桿菌EHA105
[0027] 質(zhì)粒：pMD18-T載體購(gòu)于TaKaRa生物技術(shù)公司，原核表達(dá)載體pET_28a(+)，質(zhì)粒載 體PCAMBIA2301。
[0028] 酶和主要試劑：各種限制性內(nèi)切酶如EcoR I和BamH I、BamHI和HindIlI、Taq DNA聚合酶、IPTG、dNTP等購(gòu)自TaKaRa生物技術(shù)公司，引物合成、DNA測(cè)序由上海生工技術(shù) 公司。PCR引物由Sangon生物技術(shù)公司合成，隨機(jī)引物標(biāo)記試劑盒購(gòu)自華美生物技工程公 司。
[0029] 分子生物學(xué)技術(shù)
[0030] 下列實(shí)施例中未作特別說(shuō)明的均按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行，如分子克隆采取 SAMBR00K. T等編著的實(shí)驗(yàn)手冊(cè)（New York:Cold Spring Harbor Laboratory PreSS, 1989) 中描述條件，或采取制造廠商提供的試劑盒要求之條件進(jìn)行。
[0031] 實(shí)施例1
[0032] LlRhd基因克隆
[0033] 簡(jiǎn)并引物：
[0034] 上游引物DNA序列為SEQ ID NO. 2 :
[0035] 5' -TGCATATATTAGAGGCACCTCCCTCCGT-3，。
[0036] 下游引物DNA序列為SEQ ID NO. 3 :
[0037] 5， -TACACTACACGACTCCCAACAGGAACCTC-3'。
[0038] PCR引物根據(jù)環(huán)羥基化加雙氧酶保守氨基酸序列設(shè)計(jì)：
[0039] 上游引物DNA序列為SEQ ID NO. 4 :
[0040] 5' -ATTAC TCAGCTACTTGCTTGCCTGCCGTTAC-3'。
[0041] 下游引物DNA序列為SEQ ID NO. 5 :
[0042] 5， -TACGTGCTAGCT TGCTTCACATTCAGTCACCGTCAG-3'。
[0043] 芽孢桿菌屬質(zhì)粒DNA提取按照試劑盒的說(shuō)明書上的方法提取芽孢桿菌屬質(zhì)粒。 PCR反應(yīng)體系：模板DNA 1 μ L，SEQ ID NO. 2和 SEQ ID NO. 3各 1 μ L，Taq酶0.2 μ L，10XPCR buffer 2 μ L，MgCl2I μ L，dNTP 0· 4 μ L，用 ddH20 補(bǔ)足總體積 20 μ L。PCR 反應(yīng)條件：預(yù)變 性 95°C 4min ;預(yù)擴(kuò)增 92°C lmin，58°C lmin，72°C 3min，6 個(gè)循環(huán)；9