新型溫敏熒光化合物及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及細(xì)胞檢測(cè)領(lǐng)域。具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及新型的熒光染料以及利用此類 新型熒光染料檢測(cè)活細(xì)胞內(nèi)的溫度分布。
【背景技術(shù)】
[0002] 在諸如新陳代謝、酶反應(yīng)、細(xì)胞分裂、基因表達(dá)等細(xì)胞活動(dòng)時(shí)，細(xì)胞的溫度會(huì)發(fā)生 一定變化。這些細(xì)胞活動(dòng)一般都伴隨著ATP中化學(xué)能的釋放，并產(chǎn)生熱量使得溫度上升。此 外，細(xì)胞在外界藥物或信號(hào)刺激的情況下，其新陳代謝活性會(huì)發(fā)生迅速變化，從而導(dǎo)致胞內(nèi) 溫度的劇烈波動(dòng)。然而由于胞外環(huán)境的熱交換影響，這些胞內(nèi)溫度變化通常都較為局部，并 且呈瞬態(tài)特性，因此用傳統(tǒng)的溫度測(cè)量方法較難以測(cè)量這種胞內(nèi)的溫度變化。
[0003] 據(jù)報(bào)道，紅外熱成像的方法被用來(lái)研宄UCP2在活細(xì)胞中的產(chǎn)熱作用。紅外熱成像 的原理是基于所有物體都會(huì)發(fā)射一定量與溫度相關(guān)的黑體輻射，也就是說(shuō)，用紅外熱成像 的方法，無(wú)法區(qū)分細(xì)胞的溫度與其生存環(huán)境（培養(yǎng)基）的溫度。此外，紅外相機(jī)工作波長(zhǎng)一 般是14 μ m，根據(jù)光學(xué)分辨率的瑞利準(zhǔn)則，工作在該波長(zhǎng)的紅外相機(jī)無(wú)法分辨出單個(gè)細(xì)胞。 因此紅外熱成像的方法不適用于胞內(nèi)溫度的探測(cè)。熱電偶常常作為溫度測(cè)量設(shè)備的探頭來(lái) 測(cè)量目標(biāo)的溫度變化，掃描熱成像顯微鏡是將隧道掃描顯微鏡或原子力顯微鏡的探針用熱 電偶替換而發(fā)展來(lái)的。由于熱電偶探頭較為堅(jiān)硬，該方法通常僅在電子工業(yè)中使用，以便得 到兩維的微米或者納米尺寸的熱像圖。最近報(bào)道中有學(xué)者設(shè)計(jì)了一種新型的熱電偶材料用 來(lái)測(cè)量單個(gè)細(xì)胞的實(shí)時(shí)溫度，該方法可以獲得較高時(shí)間分辨率的溫度曲線，但這只是單點(diǎn) 的測(cè)量，要得到兩維的熱像圖其時(shí)間分辨率就大打折扣，并且這種接觸式的測(cè)量，很可能破 壞細(xì)胞膜。因此基于熱電偶的溫度測(cè)量方案無(wú)法方便的對(duì)細(xì)胞進(jìn)行熱成像。
[0004] 近年來(lái)，有學(xué)者報(bào)道了溫敏熒光納米材料可用于細(xì)胞溫度變化的探測(cè)[1]，在藥物 刺激前后，整個(gè)細(xì)胞平均溫度的變化可以用平均熒光強(qiáng)度的變化來(lái)顯示。然而這種溫敏熒 光納米材料需通過(guò)注射的方法導(dǎo)入細(xì)胞，造成了對(duì)細(xì)胞的干擾和破壞；并且從報(bào)道的熒光 圖像上可以看出，該納米材料在細(xì)胞上的分布非常不均勻，只能看到一些小亮點(diǎn)[1]，而溫 敏熒光材料的熒光強(qiáng)度除了與溫度有關(guān)，與其濃度分布也有關(guān)系，簡(jiǎn)單的將整個(gè)細(xì)胞上的 熒光強(qiáng)度進(jìn)行平均來(lái)反映該細(xì)胞的溫度可能存在一定問(wèn)題。
[0005] 綜上所述，本領(lǐng)域急需開發(fā)新的熒光染料，從而能滿足測(cè)量胞內(nèi)溫度所需的小尺 寸測(cè)量和迅速測(cè)量的要求，達(dá)到空間和時(shí)間上的高分辨率，進(jìn)而獲得高時(shí)空分辨率的細(xì)胞 內(nèi)溫度分布圖像。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的主旨在于提供一種能夠定位于細(xì)胞膜或穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞的溫敏熒 光染料，從而能夠準(zhǔn)確、方便、迅速地測(cè)量胞內(nèi)溫度。
[0007] 本發(fā)明的主旨還在于提供一種利用溫敏熒光化合物測(cè)量活細(xì)胞內(nèi)溫度分布時(shí)的 溫敏熒光化合物分布校準(zhǔn)的方法以及用于所述校準(zhǔn)方法的化合物。
[0010] 其中，
[0008] 在第一方面，本發(fā)明提供式I所示化合物，[0009]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種式I所示化合物， 其中，
馬是1-22個(gè)碳原子的烴基或2-3個(gè)碳原子的酯基取代的1-3個(gè)碳原子的烷基， R5、R6、R7、馬均為徑基或H，和 Rn R2、R3、R4均為H或低級(jí)烴基； 或者 馬是2-22個(gè)碳原子的烴基或2-3個(gè)碳原子的酯基取代的1-3個(gè)碳原子的烷基，和 R5與R1, R6與R 2, &與R 3,馬與R 4相連成六元環(huán)。
2. 如權(quán)利要求1所示的化合物，其特征在于，所述化合物為下式所示化合物：
其中， R9選自：1-22個(gè)碳原子的烴基，2-3個(gè)碳原子的酯基取代的1-3個(gè)碳原子的烷基，或芳 基取代的1-3個(gè)碳原子的烷基 R5、R6、R7、R8獨(dú)立選自烴基，和 Rn R2、R3、R4均為H或低級(jí)烴基； 或者 R9選自：1-22個(gè)碳原子的烴基，2-3個(gè)碳原子的酯基取代的1-3個(gè)碳原子的烷基，或芳 基取代的1-3個(gè)碳原子的烷基，和 R5與R1, R6與R2, &與R 3,馬與R4相連成六元環(huán)。
4.如權(quán)利要求3所述的用途，其特征在于，所述化合物是下式所示化合物：

5. 如權(quán)利要求3或4所述的用途，其特征在于，所述活細(xì)胞內(nèi)溫度分布是亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的 溫度分布；優(yōu)選地，所述亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)是細(xì)胞膜、胞漿或線粒體。
6. 式I所示化合物或式2所示化合物在利用溫敏熒光化合物測(cè)量活細(xì)胞內(nèi)溫度分布時(shí) 的溫敏熒光化合物分布校準(zhǔn)中的用途， 其中，
馬是1-22個(gè)碳原子的烴基或2-3個(gè)碳原子的酯基取代的1-3個(gè)碳原子的烷基， 1?5、1?6、1?7、1?8均為!1，和 Rn R2、R3、R4均為H或低級(jí)烴基； 或者 馬是1-22個(gè)碳原子的烴基或2-3個(gè)碳原子的酯基取代的1-3個(gè)碳原子的烷基，和 R5與R1, R6與R2, &與R 3,馬與R4相連成六元環(huán)。
7. 如權(quán)利要求6所述的用途，其特征在于，所述化合物是以下化合物：
8. -種測(cè)量活細(xì)胞內(nèi)溫度分布的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟： 當(dāng)利用溫敏熒光化合物的反斯托克斯發(fā)光成像測(cè)量活細(xì)胞內(nèi)溫度分布時(shí)， (1)利用式I所示化合物對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行染色；
其中， R9選自：1-22個(gè)碳原子的烴基，2-3個(gè)碳原子的酯基取代的1-3個(gè)碳原子的烷基，或芳 基取代的1-3個(gè)碳原子的烷基， R5、R6、R7、R8獨(dú)立選自烴基，和 Rn R2、R3、R4均為H或低級(jí)烴基； 或者 R9選自：1-22個(gè)碳原子的烴基，2-3個(gè)碳原子的酯基取代的1-3個(gè)碳原子的烷基，或芳 基取代的1-3個(gè)碳原子的烷基，和 R5與R i，R6與R 2, &與R 3,馬與R 4相連成六元環(huán)； (2) 在熒光顯微鏡下對(duì)步驟（1)所述染色的細(xì)胞進(jìn)行成像； (3) 使用公式（1)對(duì)熒光圖像進(jìn)行計(jì)算： 相對(duì)焚光強(qiáng)度
其中kB是玻爾茲曼常數(shù)，T是絕對(duì)溫度，△ E是活化能，A是擬合常數(shù)，相對(duì)熒光強(qiáng)度是 式I所示化合物的反斯托克斯發(fā)光用該化合物自身的斯托克斯發(fā)光歸一化之后的比值， 預(yù)先測(cè)定相對(duì)熒光強(qiáng)度隨溫度變化的標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用公式（1)進(jìn)行計(jì)算，從而得到活 細(xì)胞內(nèi)溫度的分布圖像； 或者 當(dāng)利用溫敏熒光化合物的斯托克斯發(fā)光或反斯托克斯發(fā)光成像測(cè)量活細(xì)胞內(nèi)溫度分 布時(shí)， (1) 利用式I所示化合物以及校準(zhǔn)熒光化合物對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行同時(shí)染色； 其中，
R9選自：1-22個(gè)碳原子的烴基，2-3個(gè)碳原子的酯基取代的1-3個(gè)碳原子的烷基，或芳 基取代的1-3個(gè)碳原子的烷基， R5、R6、R7、R8獨(dú)立選自烴基，和 Rn R2、R3、R4均為H或低級(jí)烴基； 或者 R9選自：1-22個(gè)碳原子的烴基，2-3個(gè)碳原子的酯基取代的1-3個(gè)碳原子的烷基，或芳 基取代的1-3個(gè)碳原子的烷基，和 R5與R i，R6與R 2, &與R 3,馬與R 4相連成六元環(huán)； (2) 在熒光顯微鏡下對(duì)步驟（1)所述染色的細(xì)胞進(jìn)行成像； (3)根據(jù)溫度變化與相對(duì)熒光強(qiáng)度的線性關(guān)系，利用預(yù)先測(cè)得的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行計(jì)算，得 到活細(xì)胞內(nèi)溫度的分布圖像，這里的相對(duì)熒光強(qiáng)度是指溫敏熒光化合物的斯托克斯或反斯 托克斯發(fā)光強(qiáng)度用校準(zhǔn)熒光化合物的斯托克斯發(fā)光強(qiáng)度作歸一化處理所得到的比值。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述式I所示化合物是下式所示化合物：

10. 如權(quán)利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述活細(xì)胞內(nèi)溫度分布是亞細(xì)胞結(jié)構(gòu) 的溫度分布；優(yōu)選地，所述亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)是細(xì)胞膜、胞漿或線粒體。
11. 一種在利用溫敏熒光化合物測(cè)量活細(xì)胞內(nèi)溫度分布時(shí)對(duì)溫敏熒光化合物作分布校 準(zhǔn)的方法，其特征在于，所述方法利用與所用溫敏熒光化合物的細(xì)胞內(nèi)濃度分布相同，但不 具備溫敏特性的另一種熒光化合物對(duì)所述溫敏熒光化合物作分布校準(zhǔn)。
12. 如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述不具備溫敏特性的另一種熒光化合 物與所述溫敏熒光化合物共價(jià)連接；優(yōu)選地，所述不具備溫敏特性的另一種熒光化合物與 所述溫敏熒光化合物通過(guò)烴鏈共價(jià)連接；更優(yōu)選的，通過(guò)2-18個(gè)碳原子的烴鏈共價(jià)連接； 最優(yōu)選的，通過(guò)4-10個(gè)碳原子的烴鏈共價(jià)連接。
13. 如權(quán)利要求11或12所述的方法，其特征在于，所述方法中利用以下化合物對(duì)溫敏 熒光化合物作分布校準(zhǔn)：
14. 一種測(cè)量活細(xì)胞內(nèi)溫度分布的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒裝有： (1)式I所示化合物： 其中，
R9選自：1-22個(gè)碳原子的烴基，2-3個(gè)碳原子的酯基取代的1-3個(gè)碳原子的烷基，或芳 基取代的1-3個(gè)碳原子的烷基 R5、R6、R7、R8獨(dú)立選自烴基，和 Rn R2、R3、R4均為H或低級(jí)烴基； 或者 R9選自：1-22個(gè)碳原子的烴基，2-3個(gè)碳原子的酯基取代的1-3個(gè)碳原子的烷基，或芳 基取代的1-3個(gè)碳原子的烷基，和 R5與R i，R6與R 2, &與R 3,馬與R 4相連成六元環(huán)； (2) 細(xì)胞染色所用的輔助試劑； (3) 容納上述化合物和輔助試劑的容器；和 (4) 利用所述化合物測(cè)量活細(xì)胞內(nèi)溫度分布的使用說(shuō)明書。
15.如權(quán)利要求14所述的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述化合物是以下化合物：

16. 如權(quán)利要求14或15所述的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述檢測(cè)試劑盒還裝有以下 化合物：
其中， 馬是1-22個(gè)碳原子的烴基或2-3個(gè)碳原子的酯基取代的1-3個(gè)碳原子的烷基， 1?5、1?6、1?7、1?8均為!1，和 Rn R2、R3、R4均為H或低級(jí)烴基； 或者 馬是1-22個(gè)碳原子的烴基或2-3個(gè)碳原子的酯基取代的1-3個(gè)碳原子的烷基，和 R5與R1, R6與R2, &與R 3,馬與R4相連成六元環(huán)。
17. 如權(quán)利要求16所述的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述化合物是以下化合物：
【專利摘要】新型溫敏熒光化合物及其應(yīng)用。本發(fā)明提供了式I所示化合物，其中R9是1-22個(gè)碳原子的烴基或2-3個(gè)碳原子的酯基取代的1-3個(gè)碳原子的烷基，R5、R6、R7、R8均為烴基或H，和R1、R2、R3、R4均為H或低級(jí)烴基；或者，R9是2-22個(gè)碳原子的烴基或2-3個(gè)碳原子的酯基取代的1-3個(gè)碳原子的烷基，和R5與R1，R6與R2，R7與R3，R8與R4相連成六元環(huán)。本發(fā)明化合物具有溫敏特性且能進(jìn)入胞內(nèi)，從而獲得高時(shí)空分辨率的細(xì)胞內(nèi)溫度分布圖像；本發(fā)明化合物還能對(duì)溫敏熒光化合物作分布校準(zhǔn)。本發(fā)明還提供了測(cè)量活細(xì)胞內(nèi)溫度分布的方法以及相應(yīng)的檢測(cè)試劑盒。該方法滿足小尺寸測(cè)量和迅速測(cè)量的要求，從而實(shí)現(xiàn)空間和時(shí)間上的高分辨率。
【IPC分類】C07D491-22, G01K11-00, C09K11-06, C09B57-00, C07D311-82, C07D471-04
【公開號(hào)】CN104744486
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410850735
【發(fā)明人】康建勝, 謝濤嶸, 劉春鳳
【申請(qǐng)人】中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院
【公開日】2015年7月1日
【申請(qǐng)日】2014年12月31日
【公告號(hào)】WO2015101339A1