一種梅花鹿鹿茸Tβ10重組蛋白及制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種梅花鹿鹿茸Τβ 10重組蛋白及制備方法和應(yīng)用，屬于基因工程技 術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 鹿茸是一種傳統(tǒng)中藥材，在中國及周邊國家擁有廣泛的沿用歷史和經(jīng)驗(yàn)。中醫(yī)理 論認(rèn)為鹿茸具有生津補(bǔ)髓、強(qiáng)筋健骨的功效，是難得的藥食同補(bǔ)佳品?，F(xiàn)代生物學(xué)研宄發(fā) 現(xiàn)，鹿茸這些神奇的功效可能和鹿茸自身的一系列奇特的生物學(xué)現(xiàn)象間存在某種聯(lián)系。鹿 茸首先是一種可以周期性完全再生的器官，這是其他哺乳動(dòng)物器官所不具備的能力。其他 哺乳動(dòng)物包括人類的某些器官在進(jìn)化過程中喪失了再生的能力，僅有部分組織保留了有限 的再生能力，如人的指甲、肝臟等。而鹿茸可以完全再生，并且是在器官水平上的完全再生， 這一過程包括鹿茸內(nèi)部的骨組織、血管、神經(jīng)組織以及外層包裹的皮膚。再者鹿茸的再生/ 生長(zhǎng)速度極快，在某些鹿種中可以達(dá)到2cm/天。如此迅速的生長(zhǎng)速度需要一個(gè)完美的代謝 系統(tǒng)來供給充足的氧氣、養(yǎng)分及代謝物的運(yùn)輸。而鹿茸的另一個(gè)特性就是，鹿茸的軟骨組織 中富含血管，這一現(xiàn)象也是鹿茸獨(dú)有的。正是鹿茸軟骨組織中豐富的血管網(wǎng)絡(luò)保證了鹿茸 快速生長(zhǎng)的代謝需求。由于鹿茸具有獨(dú)特的生長(zhǎng)過程，對(duì)其生長(zhǎng)機(jī)制的研宄一直是生物學(xué) 研宄的熱點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 為解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種梅花鹿鹿茸Τβ 10重組蛋白及制備方 法和應(yīng)用，采用的技術(shù)方案如下：
[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種梅花鹿鹿茸T β 10重組蛋白，其特征在于，其氨基酸 序列如SEQ ID No. 1所示。
[0005] -種編碼如權(quán)利要求1所述的梅花鹿鹿茸T β 10重組蛋白的基因，其特征在于，其 核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示。
[0006] 所述梅花鹿鹿茸T β 10重組蛋白，其特征在于，在制備具有刺激血管生成作用的 藥物中的應(yīng)用。
[0007] -種如權(quán)利要求1所述的梅花鹿鹿茸T β 10重組蛋白的制備方法，該方法是構(gòu)建 鹿茸cDNA文庫，設(shè)計(jì)含有attB重組位點(diǎn)序列的引物，PCR擴(kuò)增后回收PCR產(chǎn)物，利用獲得 的PCR產(chǎn)物進(jìn)行BP重組反應(yīng)，獲得初級(jí)載體，然后進(jìn)行LR克隆反應(yīng)，獲得目標(biāo)載體，在宿主 細(xì)胞中誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白，分離純化、透析濃縮后獲得T β 10重組蛋白。
[0008] 所述方法，步驟如下：
[0009] 1)構(gòu)建鹿茸CDNA文庫，設(shè)計(jì)含有attB重組位點(diǎn)序列的引物，利用該引物和CDNA 文庫模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收PCR產(chǎn)物；
[0010] 2)將步驟1)獲得的PCR產(chǎn)物，PD0NR201質(zhì)粒和BP混合克隆酶進(jìn)行BP重組反應(yīng)， 獲得初級(jí)載體PT β 10_GWEC. 4 ;
[0011] 3)將步驟2)獲得的初級(jí)載體ρΤβ 10_GWEC. 4與PDEST17質(zhì)粒和LR克隆混合酶進(jìn) 行LR克隆反應(yīng)，獲得目標(biāo)載體ρΤβ 10-GWD17. 7,雙向DNA測(cè)序進(jìn)行鑒定；
[0012] 4)將步驟3)得到的目標(biāo)載體ρΤβ 10-GWD17. 7導(dǎo)入宿主細(xì)胞BL21-ST后，誘導(dǎo)表 達(dá)目的蛋白，分離純化、透析濃縮，獲得T β 10重組蛋白。
[0013] 優(yōu)選地，步驟1)所述引物如SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示。
[0014] 步驟1)所述PCR產(chǎn)物，是回收190bp的膠塊得到的。
[0015] 步驟4)所述誘導(dǎo)，誘導(dǎo)劑為NaCl，誘導(dǎo)濃度為0. 3M，誘導(dǎo)時(shí)間0-2h。
[0016] 所述方法具體步驟如下：
[0017] 1)利用RACE cDNA擴(kuò)增試劑盒構(gòu)建鹿茸cDNA文庫，設(shè)計(jì)含有attB重組位點(diǎn)序列 的引物，利用該引物和cDNA文庫模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，回收190bpPCR產(chǎn)物；所述引物如SEQ ID No. 3 和 SEQ ID No. 4 所示；
[0018] 2)將步驟1)獲得的PCR產(chǎn)物、pD0NR201質(zhì)粒、TE、BP反應(yīng)buffer和BP混合克隆 酶混合均勻后進(jìn)行BP重組反應(yīng)，將BP反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到DH5 α感受態(tài)細(xì)胞中，培養(yǎng)后將轉(zhuǎn)化 產(chǎn)物經(jīng)含卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基篩選，用含卡那霉素的LB培養(yǎng)基培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，獲得 初級(jí)載體 PT β 10_GWEC. 4 ;
[0019] 3)將步驟2)獲得的初級(jí)載體ρΤβ 10_GWEC.4、pDEST17質(zhì)粒、LR反應(yīng)buffer、 TE和LR克隆酶混合均勻后進(jìn)行LR克隆反應(yīng)，將LR轉(zhuǎn)化產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至BL21-ST感受態(tài)細(xì)胞 中，培養(yǎng)后將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物經(jīng)含氨芐青霉素且無 NaCL的LB固體培養(yǎng)基篩選，挑取陽性克隆，用 含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基擴(kuò)增培養(yǎng)，提取質(zhì)粒并雙向DNA測(cè)序鑒定，獲得目標(biāo)載體 ρΤβ 10-GWD17. 7 ；
[0020] 4)將步驟3)得到的ρΤ β 10-GWD17. 7導(dǎo)入宿主細(xì)胞BL21-ST細(xì)胞中，用含氨芐的 LB培養(yǎng)基37°C培養(yǎng)18h進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增，預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物于含氨芐的LB培養(yǎng)基中，在30°C培養(yǎng)條件 下培養(yǎng)至〇D_為0. 7,加入NaCl使?jié)舛葹?. 3M誘導(dǎo)0-2h，收集細(xì)胞，離心棄上清后將細(xì)胞 置于-80°C保存；
[0021] 5)將步驟4)得到的細(xì)胞解凍后用裂解液重懸，加入溶解酵素至終濃度為lmg/mL， 冰上孵育30min，超聲處理后抽提溶解產(chǎn)物，離心移入含Ni-NTA樹脂懸液的錐形瓶中，混 勻后澆灌到聚乙烯層析柱上，收集流出液，經(jīng)沖洗液沖洗，洗脫液洗脫后獲得純化的目的蛋 白，
[0022] 利用聚丙酰胺凝膠電泳檢測(cè)蛋白；
[0023] 6)將步驟5)獲得的洗脫液轉(zhuǎn)載進(jìn)透析盒中，然后轉(zhuǎn)入IL的PBS緩沖液，4°C透析 18h，
[0024] 直至樣品透析完全，置于_20°C保存，獲得目的蛋白濃縮液。
[0025] 所述方法用于制備梅花鹿鹿茸T β 10重組蛋白。
[0026] 前期通過消減抑制雜交文庫技術(shù)，發(fā)現(xiàn)了在鹿茸軟骨血管壁高度表達(dá)的小分子蛋 白THYMOSIN BETA IO(TMO)，這個(gè)分子很可是刺激鹿茸軟骨血管化的關(guān)鍵因子。
[0027] 本發(fā)明有益效果：
[0028] 本發(fā)明通過原核表達(dá)技術(shù)成功獲得了 Τβ 10的重組蛋白，經(jīng)過Huvec細(xì)胞成管實(shí) 驗(yàn)證實(shí)該蛋白具有刺激血管生成的作用。從梅花鹿鹿茸中獲取T β 10對(duì)鹿茸快速生長(zhǎng)機(jī)制 的研宄、鹿茸藥效成分的研宄以及鹿茸高科技含量產(chǎn)品的開發(fā)都具有重大意義，具有廣闊 的應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0029] 圖1為pDEST 17多克隆位點(diǎn)。
[0030] 圖2為T β重組蛋白SDS-PAGE凝膠電泳圖；
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