馬面鲀魚皮鋅螯合肽制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種水產(chǎn)品加工產(chǎn)物多肽，尤其涉及馬面飩魚皮鋅螯合肽制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]馬面飩俗名橡皮魚、剝皮魚，隸屬于飩形目、革飩科，是我國(guó)的一種常見魚類。馬面飩皮較厚且硬，無食用價(jià)值，多數(shù)扔掉，造成資源的浪費(fèi)和環(huán)境污染。鋅是人體必須的微量元素，兒童鋅缺乏可導(dǎo)致生長(zhǎng)發(fā)育不良、智力發(fā)育落后、免疫力降低等病癥；孕婦缺鋅，胎兒畸形率增高。傳統(tǒng)的鋅補(bǔ)充劑如硫酸鋅和葡萄糖酸鋅等吸收利用率低，腸胃刺激大，不利于長(zhǎng)期服用。而鋅螯合肽即可促進(jìn)鋅的吸收利用，同時(shí)又能滿足機(jī)體對(duì)活性肽、氨基酸等的需求，而且無副作用，得到了廣泛關(guān)注。
[0003]但是，申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)，以馬面飩魚皮為原料制備馬面飩魚皮鋅螯合肽及其工藝研宄處于空白。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對(duì)上述的技術(shù)現(xiàn)狀提供一種具有較強(qiáng)的鋅螯合能力、易于消化吸收和安全無毒副作用的馬面飩魚皮鋅螯合肽的制備方法。
[0005]本發(fā)明為解決上述技術(shù)問題所采取的技術(shù)方案為:馬面飩魚皮鋅螯合肽制備方法，其特征在于包括以下步驟:
I)馬面飩魚皮明膠的制備:將馬面飩魚皮絞碎，按照料液比I g: 15?20 mL加入到
0.3?0.5%的NaOH溶液中攪拌5?8 h，用雙蒸水洗至中性；然后按照I g: 10?15 mL加入到0.3?0.5%的仏504中，室溫浸泡2 d，每8 h換水一次；最后將處理過的魚皮勻漿，按照料液比I g:8?10 mL加入到雙蒸水中，于70°C動(dòng)態(tài)提取12?15 h，然后于6 OOOg離心25?30 min，取上清液，凍干得馬面飩魚皮明膠。
[0006]2)馬面飩魚皮明膠的酶解:將馬面飩魚皮明膠按照料液比I g:8?12 mL加入到巴比妥鈉-鹽酸中，調(diào)pH值至7.0，于45?50°C保溫5?10 min，按照魚皮質(zhì)量的2?3%加入中性蛋白酶(1.0 X 15 U/g)，于45?50°C酶解3?5 h，將溶液升溫至90?95°C，并于此溫度保持5?10 min后，冷卻至35?40°C ;調(diào)溶液pH值至8.0，按照明膠質(zhì)量的
1.5?2.0%向溶液中加入胰蛋白酶(1.9X 14 U/g)，于溫度35?40°C下酶解3?4 h，將溶液升溫至90?95°C，并于此溫度保持10?15min后，10 OOOg離心15?20 min，取上清液，即為酶解產(chǎn)物；
3)馬面飩魚皮鋅螯合肽的制備:將制備的酶解產(chǎn)物采用3 kDa超濾膜進(jìn)行超濾處理，收集分子量小于3 kDa部分，得超濾酶解液，超濾酶解液依次經(jīng)固定化鋅離子親和層析和反相高效液相色譜(RP-HPLC)純化，得到馬面飩魚皮鋅螯合肽。
[0007]作為優(yōu)選，所述步驟I)中的馬面飩為綠鰭?cǎi)R面飩(/ferat/oz? septentr1nalis)。
[0008]作為改進(jìn)，所述步驟3)的固定化鋅離子親和層析和反相高效液相色譜(RP-HPLC)純化的具體過程為: 固定化鋅離子親和層析:將上述超濾酶解液溶于雙蒸水配成濃度為8?10 mg/mL的溶液，經(jīng)過固定化鋅離子Sepharose 6B親和層析柱吸附后，用3?5倍柱體積雙蒸水洗脫除去未吸附的多肽，然后用5?8倍柱體積的pH 3.0的雙蒸水洗脫層析柱，收集洗脫液，凍干，得親和層析酶解物；
RP-HPLC純化:將上述親和層析酶解物用雙蒸水配成100?120 μ g/mL的溶液，利用RP-HPLC進(jìn)行純化，根據(jù)對(duì)鋅離子的螯合活性得I個(gè)高Zn螯合活性多肽Gly-P1-Tyr-Gly-Pro-Phe-Gly-Pro-Trp-Gly (GPYGPFGPffG)0
[0009]優(yōu)選，所述RP-HPLC條件為:進(jìn)樣量10?15 μ L ;色譜柱為Gemini C18 (250 X4.6mm, 5 μ m);柱溫為25?30 °C ;流動(dòng)相:30%乙腈(含0.1%三氟乙酸)；洗脫速度0.5?
0.8 mL/min ;紫外檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm。
[0010]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:本發(fā)明選用中性蛋白酶和胰蛋白酶作為酶解用酶，通過生物酶解法同時(shí)融合超濾分級(jí)和色譜精制，制得的多肽具有較強(qiáng)的鋅螯合能力，且具有易于消化吸收和安全無毒副作用等優(yōu)點(diǎn)，可用作補(bǔ)鋅藥品或功能產(chǎn)品。
[0011]
【附圖說明】
[0012]圖1是本發(fā)明的固定化鋅離子親和層析酶解物的RP-HPLC色譜圖。
[0013]
【具體實(shí)施方式】
[0014]以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。
[0015]馬面飩魚皮鋅螯合肽制備方法，工藝流程如下:馬面飩魚皮〃脫非膠原蛋白、脫鈣、提取明膠"酶解"超濾"固定化鋅離子親和層析"高效液相色譜純化"鋅螯合肽"結(jié)構(gòu)鑒定、活性評(píng)價(jià)。
[0016]實(shí)施例:
I)馬面飩魚皮明膠的制備:將綠鰭?cǎi)R面飩(#arai/o/7 septentr1nalis)魚皮絞碎，按照料液比I g: 15 mL加入到0.3%的NaOH溶液中攪拌5 h，用雙蒸水洗至中性；然后按照Ig:10 mL加入到0.4%的H2SO4中，室溫浸泡2 d，每8 h換水一次；最后將處理過的魚皮勻漿，按照料液比1:10加入到雙蒸水中，于70°C動(dòng)態(tài)提取15 h，于6 OOOg離心30 min,取上清液，凍干得馬面飩魚皮明膠。
[0017]2)馬面飩魚皮明膠的酶解:將馬面飩魚皮明膠按照料液比I g: 12 mL加入到巴比妥鈉-鹽酸緩沖液中，調(diào)pH值至7.0，于50°C保溫10 min,按照魚皮質(zhì)量的2%加入中性蛋白酶(1.0 X 15 U/g)，于50°C酶解3 h，將溶液升溫至90°C，并于此溫度保持15min后，冷卻至37°C;調(diào)溶液pH值至8.0，按照明膠質(zhì)量的1.5%向溶液中加入胰蛋白酶(1.9 X 14U/g)，于溫度37°C下酶解4 h，將溶液升溫至95°C，并于此溫度保持1min后，10 OOOg離心15 min，取上清液，即為酶解產(chǎn)物；
3)馬面飩魚皮鋅螯合肽的制備:將制備的酶解產(chǎn)物采用3 kDa超濾膜進(jìn)行超濾處理，收集分子量小于3 kDa部分，得超濾酶解液，超濾酶解液依次經(jīng)固定化鋅離子親和層析和反相高效液相色譜(RP-HPLC)純化，得到馬面飩魚皮鋅螯合肽。
[0018]①固定化鋅離子親和層析:將上述超濾酶解液溶于雙蒸水配成濃度為8?10 mg/mL的溶液，經(jīng)過固定化鋅離子Sepharose 6B親和層析柱吸附后，用3?5倍柱體積雙蒸水洗脫除去未吸附的多肽，然后用5?8倍柱體積的pH 3.0的雙蒸水洗脫層析柱，收集洗脫液，凍干，得親和層析酶解物；
②RP-HPLC純化:將上述親和層析酶解物用雙蒸水配成120 μ g/mL的溶液，利用RP-HPLC進(jìn)行純化(條件:進(jìn)樣量15 UL ;色譜柱為Gemini C18 (250 X 4.6mm, 5 μπι);柱溫為30 °C ;流動(dòng)相30%乙腈(含0.1%三氟乙酸);洗脫速度0.8 mL/min ;紫外檢測(cè)波長(zhǎng)220nm)，根據(jù)對(duì)鋅離子的螯合活性得I個(gè)高Zn螯合活性多肽(圖1)。
[0019]③結(jié)構(gòu)檢測(cè):收集Zn螯合活性最高的多肽經(jīng)檢測(cè)為單一峰，利用蛋白/多肽序列分析儀測(cè)定氨基酸序列為 Gly-Pro-Tyr-Gly-Pro-Phe-Gly-Pro-Trp-Gly (GPYGPFGPffG),ES1-MS測(cè)定分子量為1034.09 Da。
[0020]Zn螯合肽對(duì)鋅離子的螯合作用采用EDTA滴定法測(cè)定。取待測(cè)樣品100 mg放入到100 mL燒杯中，加水50 mL和HCl (6 mol/L)數(shù)滴，在水浴上加熱使樣品完全溶解，冷卻后定容至100 mL，從中吸取10 mL于三角瓶，平行3份，加入10 mL的NH3-NH4Cl緩沖液(pH10)，鉻黑T作指示劑，然后用Na2EDTA溶液(0.01 mol/L)滴定至藍(lán)色，記錄消耗EDTA的毫升數(shù)，計(jì)算螯合物含鋅量。
[0021]測(cè)定結(jié)果表明:純化得到的Zn螯合膠原肽Gly-Pro-Tyr-Gly-Pro-Phe-Gly-Pro-Trp-Gly (GPYGPFGPffG)對(duì)鋅離子的螯合能力為56.74 μ g/mg，與馬面飩魚皮明膠酶解物(23.97 μ g/mg)相比其對(duì)Zn的螯合能力有了顯著提高。
[0022]最后，尚需注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實(shí)施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.馬面飩魚皮鋅螯合肽制備方法，其特征在于包括以下步驟: 1)馬面飩魚皮明膠的制備:將馬面飩魚皮絞碎，按照料液比Ig:15mL?I g:20 mL加入到0.3?0.5%%的NaOH溶液中攪拌5?8 h，用雙蒸水洗至中性；然后按照I g:1OmL?I g: 15 mL加入到0.3?0.5%的H2SO4中，室溫浸泡2 d，每8 h換水一次；最后將處理過的魚皮勻漿，按照料液比1:10加入到雙蒸水中，于70°C動(dòng)態(tài)提取12?15 h，于6000g離心25?30 min，取上清液，凍干得馬面飩魚皮明膠； 2)馬面飩魚皮明膠的酶解:將馬面飩魚皮明膠按照料液比Ig:8?12 mL加入到巴比妥鈉-鹽酸緩沖液中，調(diào)pH值至7.0，于45?50°C保溫10?15 min，按照魚皮質(zhì)量的2?3%加入中性蛋白酶，于45?50°C酶解3?5 h，將溶液升溫至90?95°C，并于此溫度保持10?15min后，冷卻至35?40°C ;調(diào)溶液pH值至8.0，按照明膠質(zhì)量的1.5?2.0%向溶液中加入胰蛋白酶，于溫度35?40°C下酶解3?4 h，將溶液升溫至90?95°C，并于此溫度保持10?15min后，10 OOOg離心15?20 min，取上清液，即為酶解產(chǎn)物； 3)馬面飩魚皮鋅螯合肽的制備:將制備的酶解產(chǎn)物采用3kDa超濾膜進(jìn)行超濾處理，收集分子量小于3 kDa部分，得超濾酶解液，超濾酶解液依次經(jīng)固定化鋅離子親和層析和反相高效液相色譜純化，得到馬面飩魚皮鋅螯合肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述步驟I)中的馬面飩為綠鰭?cǎi)R面
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述步驟3)的固定化鋅離子親和層析和反相高效液相色譜純化的具體過程為: 固定化鋅離子親和層析:將上述超濾酶解液溶于雙蒸水配成濃度為8?10 mg/mL的溶液，經(jīng)過固定化鋅離子Sepharose 6B親和層析柱吸附后，用3?5倍柱體積雙蒸水洗脫除去未吸附的多肽，然后用5?8倍柱體積的pH 3.0的雙蒸水洗脫層析柱，收集洗脫液，凍干，得親和層析酶解物； 反相高效液相色譜純化:將上述親和層析酶解物用雙蒸水配成100?120 μ g/mL的溶液，利用RP-HPLC進(jìn)行純化，根據(jù)對(duì)鋅離子的螯合活性得I個(gè)高Zn螯合活性多肽Gly-P1-Tyr-Gly-Pro-Phe-Gly-Pro-Trp-Glyο
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述反相高效液相色譜純化條件為:進(jìn)樣量10?15 UL ;色譜柱為規(guī)格是250 X 4.6 mm, 5 μ m的Gemini C18柱；柱溫為30°C;流動(dòng)相為含0.1%三氟乙酸的30%乙腈；洗脫速度0.5?0.8 mL/min ;紫外檢測(cè)波長(zhǎng)220nmD
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種馬面鲀魚皮鋅螯合肽制備方法，具體講是以馬面鲀魚皮為原料，采用酸堿脫除魚皮非膠原蛋白和礦物質(zhì)后提取魚皮明膠，利用中性蛋白酶和胰蛋白酶對(duì)魚皮明膠進(jìn)行酶解，采用超濾、固定化鋅離子親和層析和反相高效液相色譜分離純化得到鋅螯合肽Gly-Pro-Tyr-Gly-Pro-Phe-Gly-Pro-Trp-Gly（GPYGPFGPWG），ESI-MS測(cè)定分子量為1034.09Da。
【IPC分類】C12P21-06, C07K1-20, C07K7-06, C07K1-34, C07K1-22, C07K1-36
【公開號(hào)】CN104762357
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510177269
【發(fā)明人】遲長(zhǎng)鳳, 王斌, 陳蔭, 孫坤來
【申請(qǐng)人】浙江海洋學(xué)院
【公開日】2015年7月8日
【申請(qǐng)日】2015年4月15日