一種制備魚(yú)鱗膠原蛋白活性肽的方法
【專(zhuān)利說(shuō)明】
[0001]技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及漁業(yè)加工副產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)利用領(lǐng)域，具體涉及一種采用超聲預(yù)處理及酶膜耦合反應(yīng)技術(shù)制備魚(yú)鱗膠原蛋白活性肽的一種技術(shù)。
[0002]技術(shù)背景:
膠原蛋白是構(gòu)成動(dòng)物機(jī)體的重要功能物質(zhì)，它具有其他合成高分子材料無(wú)法比擬的生物相容性和生物可降解性。目前膠原蛋白已廣泛地應(yīng)用于食品、化妝品、營(yíng)養(yǎng)保健品、生物肥料以及醫(yī)用材料等領(lǐng)域。由于魚(yú)鱗中含有豐富的膠原蛋白，以及近年來(lái)各種動(dòng)物流行疾病的發(fā)生，使得人們對(duì)來(lái)源于牲畜的膠原蛋白的安全性發(fā)生了質(zhì)疑。因此研宄和開(kāi)發(fā)魚(yú)鱗等水產(chǎn)品廢棄物中的膠原蛋白逐漸受到人們重視。魚(yú)鱗膠原蛋白是一種天然的、無(wú)毒害的、食源性好的蛋白質(zhì)，因此近年來(lái)出現(xiàn)了許多有關(guān)利用魚(yú)鱗膠原蛋白來(lái)制備具有抗氧化、降血壓活性多肽的報(bào)道。
[0003]制備膠原蛋白多肽主要的方法有酸性水解法、堿性水解法、酶水解法和發(fā)酵法。但是用酸性水解或者堿性水解得到小肽或多肽不易被人體吸收，所以現(xiàn)在膠原蛋白肽主要通過(guò)酶解法和微生物發(fā)酵法來(lái)制備。現(xiàn)在利用酶解法制備膠原蛋白肽已有大量的文獻(xiàn)報(bào)道，但是普遍存在酶解時(shí)間長(zhǎng)、酶解效率低、產(chǎn)量低、成本高等缺點(diǎn)，不適合工業(yè)化生產(chǎn)。其原因主要是在酶解過(guò)程中所產(chǎn)生的產(chǎn)物抑制效應(yīng)，底物過(guò)度水解，導(dǎo)致酶解效率低，酶解產(chǎn)量低。另一方面，酶資源的浪費(fèi)，產(chǎn)物分離成本的增加，導(dǎo)致生產(chǎn)成本增高。據(jù)報(bào)道，在蛋白底物酶解之前進(jìn)行超聲預(yù)處理可以提高酶解效果，縮短酶解時(shí)間，并且增大酶解產(chǎn)物的生物活性。另外有關(guān)報(bào)道證實(shí)，采用酶膜分離的方式可以有效的解決上述在酶解過(guò)程中存在的冋題。
[0004]酶膜耦合技術(shù)利用膜分離在酶解的同時(shí)對(duì)酶解產(chǎn)物進(jìn)行分離，目標(biāo)多肽被分離出來(lái)，酶、大分子多肽和蛋白等未反應(yīng)物返回到反應(yīng)體系繼續(xù)反應(yīng)。這種邊反應(yīng)邊分離的技術(shù)方案其優(yōu)勢(shì)在于:(I)通過(guò)產(chǎn)物的在線分離，減少產(chǎn)物抑制效應(yīng)，加快反應(yīng)速度；(2)通過(guò)產(chǎn)物的在線分離，減少產(chǎn)物的過(guò)度降解，提高產(chǎn)品活性；(3)通過(guò)酶的循環(huán)使用，提高酶的利用率。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外已有學(xué)者應(yīng)用酶膜耦合技術(shù)制備生物活性肽并取得了較好的效果?，F(xiàn)研宄的酶膜耦合方式主要有間歇式不補(bǔ)料耦合、連續(xù)式只補(bǔ)水耦合、等濃度連續(xù)補(bǔ)料耦合、梯度稀釋補(bǔ)料耦合等方式。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道中酶解-膜分離耦合技術(shù)的研宄，從間歇式的酶解-膜分離到連續(xù)性的酶解-膜分離，但連續(xù)式的酶膜耦合研宄均為只補(bǔ)水連續(xù)反應(yīng)，或者等濃度補(bǔ)料的連續(xù)反應(yīng)，只補(bǔ)水反應(yīng)會(huì)在生產(chǎn)過(guò)程中帶來(lái)大量的水分，給后期產(chǎn)物分離制備帶來(lái)很大的麻煩，并且只補(bǔ)水反應(yīng)會(huì)使酶利用率低下。等濃度補(bǔ)料的連續(xù)反應(yīng)，酶利用率較只補(bǔ)水要高，但是會(huì)存在膜污染嚴(yán)重，酶膜耦合反應(yīng)時(shí)間短，蛋白轉(zhuǎn)化率低等缺點(diǎn)。
[0005]
【發(fā)明內(nèi)容】
:
為克服已有方法的不足，本發(fā)明的目的是提供一種產(chǎn)物抑制效應(yīng)低，酶的利用酶的利用度高，生產(chǎn)成本低的制備魚(yú)鱗膠原蛋白活性肽的技術(shù)。聚能式逆流脈沖超聲波輔助酶解魚(yú)鱗膠原蛋白，強(qiáng)化酶解反應(yīng)。利用稀釋梯度補(bǔ)料酶膜耦合反應(yīng)技術(shù)制備魚(yú)鱗膠原蛋白肽，減少了產(chǎn)物抑制效應(yīng)，進(jìn)一步改善了酶解反應(yīng)效果，提高了酶的利用度，降低了生產(chǎn)成本。
[0006]為實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)手段實(shí)現(xiàn)的:先對(duì)魚(yú)鱗膠原蛋白超聲波預(yù)處理，再進(jìn)行酶膜偶聯(lián)技術(shù)制備魚(yú)鱗膠原蛋白肽，具體技術(shù)方案是:
(I)超聲的預(yù)處理:配制底物濃度為20 g/L的魚(yú)鱗膠原蛋白溶液1000 mL，經(jīng)聚能式逆流脈沖超聲波預(yù)處理12 min，超聲頻率28 kHz、超聲功率150 W、脈沖時(shí)間8 S、間歇時(shí)間
5 S0
[0007](2)酶膜耦合制備魚(yú)鱗膠原蛋白肽:將超聲預(yù)處理后的魚(yú)鱗膠原蛋白溶液pH調(diào)到8.7，并且預(yù)熱到50°C，取400 mL加入反應(yīng)器內(nèi)。加入堿性蛋白酶酶解(酶解溫度50 °C，pH8.7，加酶量0.14 AU/g)，在反應(yīng)器內(nèi)酶解25 min后啟動(dòng)超濾循環(huán)裝置，膜的截流分子量為1~3 kDa，不斷補(bǔ)加已配好濃度的底物溶液到反應(yīng)器中以維持反應(yīng)液體積恒定，實(shí)驗(yàn)以每隔5 min補(bǔ)料一次，每隔25 min降低0.2%濃度梯度。維持循環(huán)轉(zhuǎn)速為220 rpm，進(jìn)口初始?jí)毫?.1 bar，調(diào)節(jié)回流閥使出口初始?jí)毫?.3 bar，收集透過(guò)液，即可得到魚(yú)鱗膠原蛋白肽的提取液。
[0008]本發(fā)明所具有的優(yōu)點(diǎn)是:
本發(fā)明利用聚能式逆流脈沖超聲波輔助酶解魚(yú)鱗膠原蛋白，提高其酶解產(chǎn)物的ACE抑制率。再利用稀釋梯度補(bǔ)料酶膜耦合反應(yīng)技術(shù)，強(qiáng)化酶解反應(yīng)，進(jìn)行蛋白酶水解制備魚(yú)鱗膠原蛋白肽，單位酶產(chǎn)肽量為達(dá)到9.25 g肽/ (AU酶)，單位酶產(chǎn)肽量為不補(bǔ)料效率的2.71倍，改善了酶解效果，與其他酶膜耦合方式相比，單位酶產(chǎn)肽量大大提高，有效的減少了產(chǎn)物抑制效應(yīng)，提高了酶的利用度，降低了生產(chǎn)成本。下面結(jié)合【附圖說(shuō)明】及具體實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)闡述。
[0009]【附圖說(shuō)明】:
圖1為本發(fā)明使用的超聲輔助酶解-稀釋梯度補(bǔ)料酶膜耦合反應(yīng)技術(shù)制備魚(yú)鱗膠原蛋白ACE抑制肽的多頻逆流超聲波提取設(shè)備圖。
[0010]圖2為本發(fā)明使用的超聲輔助酶解-稀釋梯度補(bǔ)料酶膜耦合反應(yīng)技術(shù)制備魚(yú)鱗膠原蛋白ACE抑制狀的超濾裝置不意圖。
[0011]【具體實(shí)施方式】:
圖1為本發(fā)明使用的超聲輔助酶解-稀釋梯度補(bǔ)料酶膜耦合反應(yīng)技術(shù)制備魚(yú)鱗膠原蛋白ACE抑制肽的多頻逆流超聲波提取設(shè)備圖。將經(jīng)過(guò)雜蛋白和鈣脫除處理的魚(yú)鱗溶液加入燒杯I中，水浴加熱到設(shè)定的溫度，開(kāi)啟循環(huán)泵2轉(zhuǎn)速(180 mL/min) 一定，將溶液輸送到超聲處理室4中，保持超聲池內(nèi)液面體積不變。開(kāi)啟超聲發(fā)生器，進(jìn)行逆流超聲處理。聚能式逆流超聲提取設(shè)備的頻率為28 kHz，超聲探頭3功率為150 W?
[0012]圖2為本發(fā)明使用的超聲輔助酶解-稀釋梯度補(bǔ)料酶膜耦合反應(yīng)技術(shù)制備魚(yú)鱗膠原蛋白ACE抑制肽的超濾裝置示意圖。I和5為恒溫水浴池，根據(jù)工作需要調(diào)節(jié)介質(zhì)溫度，從而預(yù)熱補(bǔ)料罐2和酶解罐4中的液料，酶解反應(yīng)在酶解罐4中進(jìn)行。反應(yīng)25 min后啟動(dòng)超濾循環(huán)裝置，通過(guò)進(jìn)料泵6將酶解罐4中的液料輸進(jìn)膜分離裝置10中，并通過(guò)壓力表7調(diào)節(jié)進(jìn)口初始?jí)毫長(zhǎng) I bar。打開(kāi)調(diào)節(jié)回流閥9，維持壓力表8的出口初始?jí)毫?.3 bar，使一部分回流液回流到酶解罐4中。透過(guò)液通過(guò)透過(guò)液閥11從端口 12處流出并收集。反應(yīng)過(guò)程中循環(huán)轉(zhuǎn)速，溫度、PH保持恒定，并且打開(kāi)補(bǔ)料泵3不斷將