一種以鮑魚內臟為原料制備褐藻膠裂解酶的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及海洋產(chǎn)品加工領域，更具體涉及一種褐藻膠裂解酶的制備方法。
【背景技術】
[0002]褐藻膠裂解酶是一類能夠水解褐藻膠，形成褐藻膠寡糖的酶類。褐藻膠寡糖由于具有特殊的化學特性和生物活性，近年來成為一種潛在的功能產(chǎn)品不斷受到關注。而能夠實現(xiàn)褐藻膠轉變?yōu)楹衷迥z寡糖的酶-褐藻膠裂解酶也成為目前研宄的熱點。褐藻膠是由a-L-古羅糖醛酸和β-D-甘露糖醛酸組成的線性多糖。按聚合形式可以分為多聚古羅糖醛酸(PG)、多聚甘露糖醛酸(PM)和不規(guī)則雜合片段PMG。依據(jù)褐藻膠裂解酶在褐藻膠中的斷裂方式不同分為PG裂解酶、PM裂解酶和PMG裂解酶。褐藻膠裂解酶主要存在于海洋真菌和以海洋藻類為食的海洋動物體內。對于其理論及應用在國內外研宄甚少。目前主要的研宄熱點在于確定褐藻膠裂解酶酶解產(chǎn)物褐藻膠寡糖的功能活性。其主要功能活性主要有:促進植物細胞的分裂，進而促進植物的生長；促進人體內皮細胞和角化細胞的生長，具有保水特性，作為美容產(chǎn)品進行開發(fā)；調節(jié)免疫功能，增強免疫力，抗菌抗病毒等功效。
[0003]據(jù)中國漁業(yè)年鑒統(tǒng)計數(shù)據(jù)，2012年我國鮑魚產(chǎn)量為9.1萬噸，較2011年增長18.11%，并呈現(xiàn)逐年增加的趨勢。鮑魚以海藻類為食，其消化道內含有豐富的多糖水解酶類，如:纖維素酶、褐藻膠裂解酶、瓊膠酶等。鮑魚加工過程中，產(chǎn)生的大量加工下腳料-內臟，常被棄除或制備成魚粉等低值產(chǎn)品，不僅帶來嚴重的環(huán)境污染，而且造成資源的浪費。因此，以鮑魚加工副產(chǎn)物內臟為原料高效制備褐藻膠裂解酶，可有效提高鮑魚加工的附加值，降低因將內臟直接廢棄而造成的環(huán)境污染。
[0004]目前為止文獻報道的關于褐藻膠裂解酶的分離純化主要采用硫酸銨分級沉淀以及多步柱層析相結合的方法，分離純化過程繁瑣，操作復雜、耗時長、得率低、成本高，難于實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。

【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種工藝簡單、分離效果好，能夠實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)的鮑魚內臟褐藻膠裂解酶的制備方法。
[0006]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種以鮑魚內臟為原料制備褐藻膠裂解酶的方法，其特征在于包括如下步驟:
1)粗酶提取:將鮑魚內臟切碎，加入TriS-HCl緩沖液，組織搗碎，離心，上清液即為粗酶液；
2)活性炭處理:所述粗酶液經(jīng)過活性炭處理后過濾除去活性炭，所得為濾液；
3)陰離子交換柱層析:將所得濾液經(jīng)DEAE-Sepharose、DEAE-Sephacel或Q-Sepharose陰離子交換樹脂，吸附后的樹脂經(jīng)階段淋洗解吸，得到較高純度的褐藻膠裂解酶；
4)膜處理1:將有褐藻膠裂解酶活性部分淋洗液用100-50 kDa分子量截留的超濾膜超濾除雜，得到高純度的褐藻膠裂解酶； 5)將上述超濾外液部分用10-3kDa分子量截留的超濾膜超濾濃縮；
6)酶制劑制備:將所述濃縮液經(jīng)噴霧干燥或冷凍干燥，得到高純度、高活力的褐藻膠裂解酶制品；
任選的，所述噴霧干燥前在所述濃縮液中加入海藻糖或β-環(huán)糊精。
[0007]所述步驟I)中，加入4倍體積20 mmol/L pH 8.5的Tris-HCl緩沖液；所述離心為 12000 Xg 離心 20 min。
[0008]所述步驟2)中，所述活性炭加入量為(W/V)0.5-3 % (指的是活性炭(w)占粗酶液(V)的比例)，處理方式為4°C攪拌處理30-60 min。
[0009]所述步驟3)中，所述階段淋洗解吸為吸附后的樹脂經(jīng)0.05,0.1,0.2、0.3 mo I/LNaCl鹽濃度階段洗脫。
[0010]所述步驟5)中，所述海藻糖或β -環(huán)糊精的加入量為10-30重量體積％。
[0011]本發(fā)明通過活性炭吸附去除大量的色素，同時達到脫腥脫色的效果；利用陰離子交換柱層析能將褐藻膠裂解酶有效吸附，通過改變鹽濃度階段淋洗方式，將褐藻膠裂解酶和雜蛋白(如:細胞骨架蛋白、纖維素酶、組織蛋白酶等含量較高的蛋白)得到很好的分離。本發(fā)明在離子交換柱層析之后，采用超濾膜對褐藻膠裂解酶進行超濾除雜、濃縮，既實現(xiàn)了褐藻膠裂解酶的純化，又能夠將樣品濃縮到較小體積，方便了后續(xù)噴霧干燥或冷凍干燥過程，節(jié)約了能源。噴霧干燥過程中，在酶液中添加海藻糖或環(huán)糊精等保護劑，保護了酶的活性。
[0012]綜上所述，本發(fā)明采用活性炭脫色脫腥，離子交換柱層析除雜蛋白，膜過濾除雜、噴霧干燥等技術從鮑魚內臟中獲得了純度高、活力好的褐藻膠裂解酶，該工藝經(jīng)放大后可應用于工業(yè)化生產(chǎn)。
[0013]本發(fā)明通過活性炭吸附，去除了部分的色素蛋白、多糖；進而采用離子交換柱層析，運用階段洗脫方式去除大量的雜蛋白，簡化了純化工藝，獲得了高純度的褐藻膠裂解酶。本發(fā)明避免了現(xiàn)有技術中采用的硫酸銨鹽析、多步柱層析結合的方法，簡化了工藝流程，節(jié)約了生產(chǎn)成本，能夠進行技術規(guī)模放大，具有良好的應用前景。
【附圖說明】
[0014]圖1為本發(fā)明純化褐藻膠裂解酶的SDS-PAGE電泳圖。
[0015]圖2為所制備得到的肽質量指紋圖譜獲得的序列與其他物種褐藻膠裂解酶序列比對圖。
[0016]圖3為將制備的褐藻膠裂解酶對褐藻膠的分解效果及粘度變化圖。
[0017]圖4為將制備的褐藻膠裂解酶對褐藻膠的分解粘度變化圖。
【具體實施方式】
[0018]下面詳細描述本發(fā)明的實施例，所述實施例的示例在附圖中示出，其中自始至終相同或類似的標號表示相同或類似的元件或具有相同或類似功能的元件。下面通過參考附圖描述的實施例是示例性的，旨在用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對本發(fā)明的限制。實施例中未注明具體技術或條件者，按照本領域內的文獻所描述的技術或條件或者按照產(chǎn)品說明書進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
[0019]實施例1:褐藻膠裂解酶的制備
1.粗酶提取:取150g鮑魚內臟，切碎，加入600 mL體積20 mmol/L Tris-HCl (pH8.5)，組織搗碎，12000 X g離心20 min,取上清，得到650 mL粗酶液；
2.活性炭處理:向650mL粗酶液中加入3.25 g活性炭，在4 °C下攪拌吸附30 min。吸附后用濾紙片進行抽濾，得630 mL濾液；
3.陰離子交換柱層析:上述經(jīng)活性炭吸附后的濾液上樣于用20mmol/L Tris-HCl(pH 8.5)平衡好的DEAE-Sepharose陰離子交換柱(2.5 X 10 cm)，流速1.0 mL/min。上樣完成后用20 mmol/L Tris-HCl (pH 8.5)充分流洗至流出液在280 nm處的吸光度值到基線。然后用含0.05 mol/L、0.1 mol/L、0.2 mol/L、0.3 mol/L NaCl 的 20 mmol/L Tris-HCl(pH 8.5)緩沖液分別進行階段淋洗，收集0.1 mol/L NaCl淋洗液(5 mL/管)得到較高純度的褐藻膠裂解酶，共400 mL ；
4.膜處理1:將得到的含有高純度的褐藻膠裂解酶洗脫液用50kDa超濾膜超濾，得到360 mL超濾外液；
5.膜處理2:將上述超濾杯外液用3 kDa超濾膜濃縮，得濃縮液50 mL ;
6.酶制劑制備:將50mL濃縮液進行冷凍干燥，得到酶制劑。
[0020]實施例2:褐藻膠裂解酶的制備
1.粗酶提取:取600g鮑魚內臟，切碎，加入2.4 L 20 mmol/L Tris-HCl (pH 8.5),組織搗碎，12000 X g離心20 min,