采用谷氨酸鈉耐受性模型篩選達(dá)托霉素高產(chǎn)菌株的方法
【專利說明】采用谷氨酸納耐受性模型篩選達(dá)托霉素高產(chǎn)菌株的方法
[0001]
技術(shù)領(lǐng)域： 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體設(shè)及一種氨基酸耐受性模型篩選達(dá)托霉素高產(chǎn)菌株的 方法。
[0002]
【背景技術(shù)】： 被稱為"超級(jí)病菌"的耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌， (Methicillin-resistantStaphylococ州Saureus,MRSA)在各國的傳播越來越迅 速，已經(jīng)嚴(yán)重威脅到人類的健康和生命。臨床上只有萬古霉素（Vancomycin)對(duì)MRSA有抑 制作用，隨著萬古霉素在MRSA感染中應(yīng)用的增加，臨床上已出現(xiàn)了感染的金黃色葡萄球 菌對(duì)萬古霉素敏感度減為中度敏感的現(xiàn)象。 達(dá)托霉素值aptomycin)被公認(rèn)為在萬古霉素之后的最佳備用抗生素，是美國禮萊公 司20世紀(jì)80年代發(fā)現(xiàn)的新型脂膚類抗生素，對(duì)MRSA有明顯的抑制作用，除抗MRSA之 夕K達(dá)托霉素還對(duì)絕大多數(shù)的革蘭氏陽性菌有抑制作用。據(jù)報(bào)道，達(dá)托霉素對(duì)2002~ 2005年從美國和加拿大各醫(yī)院收集的19615株臨床革蘭氏陽性菌中的99%存在抑制作用。 達(dá)托霉素在生物膜中的擴(kuò)散速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過一般藥物，因此作用速度快且具濃度依賴性，可 產(chǎn)生抗生素后效應(yīng)，不易與其它抗生素產(chǎn)生交叉耐藥性。自從2003年9月FDA(美國食品 與藥物管理局）首次批準(zhǔn)化bicin(Daptomycin注射劑）用于治療復(fù)雜皮膚和皮膚結(jié)構(gòu)感 染W(wǎng)來，達(dá)托霉素在臨床上應(yīng)用越來越多，市場(chǎng)上對(duì)達(dá)托霉素的需求量越來越大。達(dá)托 霉素由13個(gè)氨基酸組成，其中左側(cè)10個(gè)氨基酸形成一個(gè)膚環(huán)，位于右側(cè)的3個(gè)氨基酸組成 了環(huán)外的尾己。13個(gè)氨基酸有兩個(gè)屬于非天然氨基酸：犬尿氨酸化yn)和3-甲基谷氨酸 (3mGlu)，它們僅存在于達(dá)托霉素中。目前由于3-甲基谷氨酸原料的缺乏，用化學(xué)合成或化 學(xué)與酶結(jié)合催化的方法改造達(dá)托霉素母核很困難。
[0003]

【發(fā)明內(nèi)容】
： 本發(fā)明的目的是提供了一種培養(yǎng)基原料來源廣，成本低，出發(fā)菌株正突變株的幾率高、 突變株達(dá)托霉素效價(jià)高的谷氨酸鋼耐受性模型篩選達(dá)托霉素高產(chǎn)菌株的方法。
[0004] 本發(fā)明是該樣實(shí)現(xiàn)的： 采用谷氨酸鋼耐受性模型篩選達(dá)托霉素高產(chǎn)菌株的方法，包括如下步驟： (1) 初篩；將誘變處理的玫瑰抱鏈霉菌單抱子懸浮液稀釋后涂布于含有谷氨酸鋼耐受 量為150-200 g/L的分離培養(yǎng)基上，在30°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7-10天，挑選耐谷氨酸鋼的玫 瑰抱鏈霉菌單菌落接種于斜面培養(yǎng)基上，30°C培養(yǎng)7-10天，斜面產(chǎn)抱后接種于種子培養(yǎng) 基中，30°C培養(yǎng)4她后接種于含谷氨酸鋼量不同的發(fā)酵培養(yǎng)基，30°C培養(yǎng)16她后測(cè)定效價(jià)， 挑選出效價(jià)高的玫瑰抱鏈霉菌菌株； (2) 復(fù)篩；將效價(jià)較高的玫瑰抱鏈霉菌菌株接種于種子培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)4她后，挑 選菌絲生長(zhǎng)良好的菌株接種于含谷氨酸鋼量不同的發(fā)酵培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)16她后測(cè)定 效價(jià)； (3) 發(fā)酵培養(yǎng)基試驗(yàn)；將效價(jià)較高的玫瑰抱鏈霉菌菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)基試驗(yàn)，將（2)中 培養(yǎng)好的玫瑰抱鏈霉菌種子接到含谷氨酸鋼量不同的的發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為5%，V/V， 30°C培養(yǎng)16她后測(cè)定效價(jià)，挑選出效價(jià)高的玫瑰抱鏈霉菌菌株即成，或者將（2)中培養(yǎng)好 的玫瑰抱鏈霉菌種子接到含谷氨酸鋼量為3或5或10或15g/L的發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量 為5%，V/V，30°C培養(yǎng)16她后即成。
[0005] 所述的（1)步驟中所用分離培養(yǎng)基成分和含量為；可溶性淀粉20. 0g/l，硫酸儀 1.0 g/l，硝酸鐘1.0g/l，硫酸亞鐵0.01g/l，氯化鋼0. 5g/l，磯酸氨二鐘0. 5g/l，谷氨 酸鋼 150g/L，瓊脂 15. 0g/L，抑7. 2-7. 4。
[0006] 所述的（1)步驟中所用斜面培養(yǎng)基成分和含量為；可溶性淀粉20.0g/l，硫酸儀 1.0g/l，硝酸鐘1.0g/l，硫酸亞鐵0.01g/l，氯化鋼0.5g/l，磯酸氨二鐘0.5g/l，瓊脂 15. 0g/L，抑7. 2-7. 4。
[0007] 所述的（1)、（2)和（3)步驟中所用的種子培養(yǎng)基成分和含量為；糊精15g/l，葡萄 糖5g/l，花生餅粉5g/l，酵母粉5g/l，蛋白腺5g/l，磯酸氨二鐘0. 5g/l，硫酸儀0. 2 g/L硫酸亞鐵 0. 004g/L，pH7. 5。
[000引所述的（1 )、（ 2 )和（3 )步驟中所用的含谷氨酸鋼量不同的發(fā)酵培養(yǎng)基含谷氨酸鋼 分別為3.0 -15g/L中之一，其他成分和含量均為；糊精35g/l，葡萄糖5g/L，黃豆餅粉 22g/l，硫酸鐘 5g/l，抑7. 5。
[0009] 含谷氨酸鋼量不同的發(fā)酵培養(yǎng)基含谷氨酸鋼分別為5. 0 -15g/L中之一。
[0010] 所述誘變處理為將出發(fā)菌株玫瑰抱鏈霉菌成熟斜面用生理鹽水制成單抱子懸液， 經(jīng)振蕩，玻璃珠分散15min，無菌過濾收集單抱子懸液約5ml于無菌培養(yǎng)皿中，使其抱子的 終濃度達(dá)到1〇6-1〇7個(gè)/ml,紫外功率30W，燈距35cm照射60s。
[ocm] 所述誘變處理為將出發(fā)菌株玫瑰抱鏈霉菌成熟斜面用PH7. 0的磯酸鐘緩沖液成 單抱子懸液，經(jīng)振蕩，玻璃珠分散15min，無菌過濾收集單抱子懸液約5ml，使其抱子的終濃 度達(dá)到106-107個(gè)/ml,加入燒化劑甲基橫酸己醋EMS，終濃度為5%，振蕩處理45min，加入 硫代硫酸鋼終止反應(yīng)，振蕩lOmin。
[0012] 利用達(dá)托霉素產(chǎn)生菌玫瑰抱鏈霉菌可能作為前體的物質(zhì)或前體的結(jié)構(gòu)類似物(谷 氨酸鋼）加入到分離培養(yǎng)基中，觀察出發(fā)菌株玫瑰抱鏈霉菌對(duì)谷氨酸鋼的耐受情況，確定其 最低耐受谷氨酸鋼劑量，選用出發(fā)菌株玫瑰抱鏈霉菌在高濃度下不能生長(zhǎng)的谷氨酸鋼，作 為篩選模型。
[0013] 經(jīng)過誘變后的玫瑰抱鏈霉菌菌種，用本發(fā)明所建立的篩選模型進(jìn)行篩選，對(duì)出發(fā) 菌株因不能耐受高濃度谷氨酸鋼而不能生長(zhǎng)的模型，如果在誘變后能生長(zhǎng)，說明玫瑰抱鏈 霉菌對(duì)該種濃度的谷氨酸鋼能耐受，玫瑰抱鏈霉菌代謝途徑和代謝流一定發(fā)生了變化，就 有可能篩選得到達(dá)托霉素高產(chǎn)的玫瑰抱鏈霉菌突變株。
[0014] 利用達(dá)托霉素產(chǎn)生菌玫瑰抱鏈霉菌可能作為前體的物質(zhì)或前體的結(jié)構(gòu)類似物(谷 氨酸鋼）進(jìn)行抗性篩選是可行的方法。將谷氨酸鋼加入到分離培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選發(fā)現(xiàn)：能 耐受谷氨酸鋼的玫瑰抱鏈霉菌突變株其產(chǎn)生正突變株的幾率最高。因此選用谷氨酸鋼作為 篩選模型來進(jìn)行玫瑰抱鏈霉菌高產(chǎn)菌株的篩選。觀察玫瑰抱鏈霉菌菌株對(duì)谷氨酸鋼的耐受 情況（即觀察平板上有無菌落生長(zhǎng))，確定其最低耐受劑量。其耐受劑量的確定采用如下方 法：將經(jīng)過誘變后的玫瑰抱鏈霉菌單抱子懸液經(jīng)適當(dāng)稀釋后分別涂布在含有不同濃度谷氨 酸鋼的分離培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，出發(fā)菌株作為對(duì)照品同時(shí)培養(yǎng)。觀察不同濃度平板上菌落 的生長(zhǎng)情況，如果某個(gè)濃度的平板上無菌落生長(zhǎng)，就可確定該濃度為谷氨酸鋼的最低抑制 濃度。選用出發(fā)菌株玫瑰抱鏈霉菌在高濃度下不能生長(zhǎng)的谷氨酸鋼，作為篩選模型。
[0015] 本發(fā)明就是基于W上的原理而進(jìn)行的方法。經(jīng)長(zhǎng)期大量的試驗(yàn)證明，在本發(fā)明的 誘變條件下，玫瑰抱鏈霉菌經(jīng)過誘變