通過(guò)沉默番茄基因SlNZG培育耐貯番茄植株的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及通過(guò)沉默番茄基因S1NZG培育耐貶番茄植株 的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 番茄是一種深受人們所喜愛(ài)的世界性蔬菜，而番茄營(yíng)養(yǎng)豐富，具特殊風(fēng)味。具有減 肥瘦身、消除疲勞、增進(jìn)食欲、提高對(duì)蛋白質(zhì)的消化、減少胃脹食積等功效。在自然界中，果 實(shí)軟化有利于種子的傳播和物種的穩(wěn)定；而在農(nóng)業(yè)和商業(yè)生產(chǎn)中，果實(shí)軟化有利于改善口 感和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。但是，果實(shí)過(guò)度軟化后易發(fā)生腐爛、變質(zhì)，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。在自然條 件下，番茄未成熟果實(shí)可W室溫保持2個(gè)月左右，而成熟的紅果實(shí)只能保持30天左右。在 番茄成熟到運(yùn)輸轉(zhuǎn)賣(mài)W及貶藏過(guò)程中，會(huì)有大量的番茄腐爛浪費(fèi)。而近年來(lái)，隨著基因工程 的迅速發(fā)展和RNAi技術(shù)體系的日益完善，基因工程技術(shù)在提高番茄耐貶性性方面顯示了 極大的潛力。目前，基因工程技術(shù)已廣泛的用于番茄品種的改良和育種中。利用基因工程 技術(shù)快速獲得穩(wěn)定遺傳的番茄新品種必將是當(dāng)前和未來(lái)的發(fā)展趨勢(shì)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供通過(guò)沉默番茄基因S1NZG培育耐貶番茄植株的 方法，該方法簡(jiǎn)單，能夠獲得耐貶番茄品種。
[0004] 為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：
[0005] 通過(guò)沉默番茄基因S1NZG培育耐貶番茄植株的方法，包括如下步驟：將SEQID NO. 3所示核巧酸序列反向連入地inl9載體SacI和甜aI酶切位點(diǎn)處，得RNAi載體 地inl9: :S1NZG;然后將地inl9: :S1NZG載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，獲得農(nóng)桿菌工程菌，再W農(nóng)桿菌 工程菌轉(zhuǎn)染經(jīng)過(guò)切割并預(yù)培養(yǎng)的番茄外植體，經(jīng)共培養(yǎng)、誘導(dǎo)生芽及生根培養(yǎng)，最后篩選轉(zhuǎn) 基因番茄植株，得耐貶性番茄植株。
[0006] 優(yōu)選的，所述SEQIDNO. 3所示核酸序列由W下方法制備；WSEQIDNO. 1和SEQ IDN0.2所示序列為引物，番茄cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后得SEQID NO. 3所示核酸序列；所述PCR擴(kuò)增的程序?yàn)?4°C預(yù)變性5min;94°C變性30s，56°C退火30s， 72°C延伸Imin，共35個(gè)循環(huán)；最后72°C后延伸lOmin。
[0007] 優(yōu)選的，所述RNAi載體地inl9::SlNZG的構(gòu)建方法為將SEQIDNO. 3用Kpn I和化oI雙酶切，再與經(jīng)同樣雙酶切的pHANNIBAL載體連接，獲得RNAi中間載體 pHANNIBAL: :SlNZG(i)，然后用SacI和SpeI雙酶切中間載體pHANNIBAL: :SlNZG(i)，再與 經(jīng)SacI和甜aI雙酶切的地inl9載體連接，得RNAi載體地IN19::S1NZG。
[0008] 優(yōu)選的，制備農(nóng)桿菌工程菌的方法是將農(nóng)桿菌單菌落、含有游動(dòng)質(zhì)粒PRK2013的 大腸桿菌單菌落和含有重組質(zhì)粒地inl9: :S1NZG的大腸桿菌D冊(cè)a單菌落依次重疊均勻涂 在含有1. 2% (w/w)瓊脂的抑7. 2的YEB固體培養(yǎng)基中央直徑為1cm的圓圈中，28 + 2°C黑 暗條件下倒置共培養(yǎng)24小時(shí)至長(zhǎng)出菌團(tuán)，用接種環(huán)挑取菌團(tuán)，在含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.2%的 瓊脂、50mg/L利福平、500mg/L鏈霉素和50mg/L卡那霉素的抑7. 2的YEB固體培養(yǎng)基中劃 線，28±2°C黑暗條件下倒置培養(yǎng)2-2. 5天至長(zhǎng)出單菌落，挑取3-4個(gè)單菌落，用含有50mg/ L利福平、500mg/L鏈霉素和50mg/L卡那霉素的抑7. 2的YEB液體培養(yǎng)基，在28±2°C、黑 暗、200巧m條件下?lián)u床培養(yǎng)1. 5天至菌液均勻且ODe。。為1. 8-2. 0,提取重組質(zhì)粒，用EcoRI 和甜al進(jìn)行雙酶切鑒定，陽(yáng)性重組子即為農(nóng)桿菌工程菌。
[0009] 優(yōu)選的，預(yù)培養(yǎng)番茄外植體的步驟如下：
[0010] a.用體積分?jǐn)?shù)為75%的酒精浸泡番茄種子2min，無(wú)菌水沖洗3次；再用滅菌的飽 和化3PO4浸泡種子2〇min，然后用無(wú)菌水沖洗3次；接著用1% (V/V)的化CIO水溶液浸泡 種子lOmin，無(wú)菌水沖洗7次；再用無(wú)菌水浸泡種子化后將番茄種子播種在MS固體培養(yǎng)基 上，然后于28°C光照1化和18°C黑暗她的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，且光照強(qiáng)度為1000-20001X，所述 MS固體培養(yǎng)基為庶糖終質(zhì)量濃度3%、瓊脂終質(zhì)量濃度0. 6-0.8%的抑5. 9的MS培養(yǎng)基；
[0011] b.待種子萌發(fā)長(zhǎng)出子葉得番茄外植體，然后將番茄外植體的子葉切下，在MS液體 培養(yǎng)基中浸泡比，濾紙吸干殘留液體培養(yǎng)基并放置在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3 %的庶糖、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0.8%的瓊脂、Img/L嘲噪己酸、1. 75mg/L玉米素、抑為5. 9的MS固體培養(yǎng)基中，28°C光照 1化和18°C黑暗預(yù)培養(yǎng)Id得預(yù)培養(yǎng)番茄外植體。
[0012] 優(yōu)選的，所述轉(zhuǎn)染為將預(yù)培養(yǎng)番茄外植體置于農(nóng)桿菌工程菌中浸染15分鐘。
[0013] 優(yōu)選的，所述共培養(yǎng)為將轉(zhuǎn)染后的番茄外植體于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的庶糖、質(zhì)量分 數(shù)為0.8%的瓊脂、1111徑/1嘲噪己酸、1.75111徑/1玉米素、抑為5.9的15固體培養(yǎng)基中，在 28±2°C黑暗條件下共培養(yǎng)48小時(shí)。
[0014] 優(yōu)選的，所述誘導(dǎo)生芽為將共培養(yǎng)后的番茄外植體于含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的庶 糖、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為〇.8%的瓊脂、1.〇111肖/1嘲噪己酸、1.75111肖/1玉米素、50〇111肖/1駿節(jié)青霉素和 50mg/L卡那霉素、抑為5. 9的MS固體培養(yǎng)基中，在28°C光照16h、18°C黑暗她、光照強(qiáng)度 1000-20001X條件下誘導(dǎo)生芽。
[0015] 優(yōu)選的，所述生根培養(yǎng)為將長(zhǎng)至2~3cm的芽切下，轉(zhuǎn)入含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的庶 糖、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 8%的瓊脂、250mg/L駿節(jié)青霉素和50mg/L卡那霉素、抑為5. 9的MS固 體培養(yǎng)基中，在28°C光照16h、18°C黑暗她、光照強(qiáng)度1000-20001X條件下培養(yǎng)至生根。
[0016] 優(yōu)選的，所述篩選轉(zhuǎn)基因番茄植株的方法是WSEQIDNO. 4和SEQIDNO. 5所示 序列為引物，生根番茄植株基因組DM為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分 析，PCR產(chǎn)物在900bp位置出現(xiàn)目標(biāo)DNA條帶則為轉(zhuǎn)基因番茄植株；所述PCR擴(kuò)增程序?yàn)?94°C預(yù)變性5min;94°C變性30s;56°C退火30s;72°C延伸Imin，共35個(gè)循環(huán)；72°C后延伸 lOmin。
[0017] 本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明利用番茄SINZG基因核屯、片段構(gòu)建番茄SINZG基 因沉默的RNAi載體，將該RNAi載體轉(zhuǎn)入番茄，所得S1NZG基因沉默番茄陽(yáng)性植株中S1NZG 基因的表達(dá)均較野生型植株顯著降低，成功獲得了耐貶性番茄品種。與傳統(tǒng)育種方法通過(guò) 雜交等方法培育高產(chǎn)品種的周期長(zhǎng)、耗資多、增產(chǎn)效果不理想且不可穩(wěn)定遺傳相比，本發(fā)明 采用基因工程技術(shù)，高效并可穩(wěn)定遺傳地提高了番茄果實(shí)的耐貶性W及抗病菌感染能力的 特征。為番茄的品種改良作出了積極的探索，也為其他植物的耐貶性育種提供了參考和借 鑒，所得耐貶性番茄新品種具有良好的市場(chǎng)應(yīng)用前景和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
【附圖說(shuō)明】
[0018] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖：
[0019] 圖1為番茄S1NZG基因核屯、段和重組質(zhì)粒pHANNIBAL::SlNZG構(gòu)建的瓊脂糖凝 膠電泳分析圖（A為PCR擴(kuò)增S1NZG基因核屯、片段，1和2為擴(kuò)增結(jié)果，M為Marker;B為 中間載體PHANNIBAL::S1NZG的PCR鑒定結(jié)果，1為擴(kuò)增結(jié)果，M為Marker;C為終載體 地IN19: :S1NZG的PCR鑒定結(jié)果，1為擴(kuò)增結(jié)果，2為陰性對(duì)照，M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)（Maker, 單位bp))。
[0020] 圖2為S1NZG基因沉默番茄植株。
[002U圖3為PCR檢測(cè)NPTII報(bào)告基因在S1NZG基因沉默番茄植株中的表達(dá)（M為DL2000plus 為7個(gè)獨(dú)立S1NZG基因沉默株系）。
[0022] 圖4為S1NZG基因在S1NZG基因沉默番茄陽(yáng)性植株中的沉默效果鑒定（AC為野生 型番茄，1#-3#為不同的S1NZG基因沉默番茄陽(yáng)性株系）。
[0023] 圖5為S1NZG基因沉默番茄陽(yáng)性植株果實(shí)耐貶性鑒定結(jié)果圖（AC為野生型番茄 B+4果實(shí)，1#和2#為S1NZG基因沉默陽(yáng)性植株B+4果實(shí)，上面是剛采摘果實(shí)，下層為常溫放 置兩個(gè)月果實(shí)）。
【具體實(shí)施方式】
[0024] W下將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。應(yīng)當(dāng)理解，優(yōu)選實(shí)施例 僅為了說(shuō)明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。優(yōu)選實(shí)施例中未注明具體條件的 實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實(shí)驗(yàn)指南（第=版，J.薩姆布魯克等著，黃培 堂等譯，科學(xué)出版社，2002年）中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。<