一種內(nèi)含肽介導(dǎo)的對(duì)重組蛋白定點(diǎn)聚乙二醇修飾的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及對(duì)多膚、蛋白質(zhì)等重組功能性蛋白的特異性定點(diǎn)修飾方法，具體設(shè)及 利用內(nèi)含膚的介導(dǎo)對(duì)干擾素a進(jìn)行定點(diǎn)聚己二醇修飾的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 近30年來(lái)，基因重組技術(shù)得到了巨大的發(fā)展，對(duì)生物技術(shù)領(lǐng)域產(chǎn)生了深刻的革命 性影響，出現(xiàn)的基因工程蛋白藥物對(duì)現(xiàn)代醫(yī)藥產(chǎn)生了巨大的影響，與傳統(tǒng)小分子化學(xué)藥物 相比，蛋白藥物具有劑量少，毒副作用小，藥效高等顯著優(yōu)勢(shì)。然而蛋白藥物也有些缺點(diǎn)，如 免疫原性強(qiáng)，體內(nèi)半衰期短，容易被蛋白酶降解等。
[0003] 聚己二醇化（PEG化）修飾技術(shù)是針對(duì)蛋白藥物的缺點(diǎn)進(jìn)行的有效改良，能顯著降 低蛋白藥物的免疫原性，屏蔽蛋白酶酶切位點(diǎn)，降低腎清除率，延長(zhǎng)體內(nèi)的半衰期等。PEG化 修飾是用于改良蛋白質(zhì)藥代動(dòng)力學(xué)的得到最廣泛使用和認(rèn)可的方法。PEG是基于重復(fù)單元 (-C2H3-0-)n的具有低分散性的廣范圍分子量的聚合物，并且陽(yáng)G分子可W是直鏈和支鏈 兩種形式。其高度柔性和水和作用，是其具有大的水力半徑并顯著提高與之連接的蛋白的 大小，從而顯著降低其腎清除率，此外，潛在的免疫原性表位和蛋白酶切割位點(diǎn)被掩蔽，從 而分別降低免疫原性和蛋白水解。另外，PEG化可W實(shí)質(zhì)上提高蛋白溶解性和穩(wěn)定性。然 而，用于陽(yáng)G化的修飾方法一般都是非位點(diǎn)選擇性的，主要是針對(duì)賴(lài)氨酸側(cè)鏈上的氨基基 團(tuán)。該通常會(huì)生成不同修飾個(gè)數(shù)，不同修飾位點(diǎn)的修飾后蛋白混合物。如Roche公司的長(zhǎng) 效干擾素藥物PEGASYES(商品名；派羅欣），而且，非定點(diǎn)的修飾會(huì)導(dǎo)致蛋白藥物活力位點(diǎn) 因被PEG屏蔽而降低或喪失，PEGASYS經(jīng)PEG修飾后，活力僅為修飾前的7%。因此，蛋白藥 物的PEG定點(diǎn)（位點(diǎn)選擇性）修飾技術(shù)是非常必要的，其可W克服非定點(diǎn)PEG化的缺點(diǎn)。
[0004] 目前，已有一些研究用于蛋白定點(diǎn)PEG修飾的方法和途徑。Marsac等人借助 PEG-硫醋與祀蛋白上的N末端半脫氨酸之間的天然化學(xué)連接將陽(yáng)G連接至蛋白N末端。 Kinstler等人借助酸性條件下蛋白與陽(yáng)G醒的還原性燒化與PEGN末端連接，在酸性條件 下，只有N末端a-氨基是反應(yīng)性的，pKa比賴(lài)氨酸殘基的￡-氨基低，然而，用該方法仍然 可能獲得一些e-氨基PEG化。Brocchini等人將PEG并入二硫橋，W二硫化物起始還原， W釋放2個(gè)半脫氨酸硫醇，隨后是雙烷基化，W產(chǎn)生PEG共價(jià)連接的S碳橋。然而，該方法 僅限于在溶劑中暴露有二硫鍵的蛋白。因此，需要建立一種不受蛋白質(zhì)氨基酸序列限制的 廣譜的蛋白藥物的PEG定點(diǎn)修飾技術(shù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了解決現(xiàn)有技術(shù)中的不足，本發(fā)明的目的是提供對(duì)多膚、蛋白質(zhì)等重組功能性 蛋白的特異性定點(diǎn)PEG修飾方法，利用內(nèi)含膚獨(dú)特的蛋白質(zhì)自剪切功能，在溫和的條件下， 創(chuàng)新性的定點(diǎn)連接PEG到目的蛋白的C末端。
[0006] 內(nèi)含膚（Intein)是寄生在其它蛋白質(zhì)中的一段多膚鏈，其編碼DNA序列與正常 蛋白的外顯子一起轉(zhuǎn)錄和翻譯，產(chǎn)生一條多膚鏈，然后從中切除與內(nèi)含膚對(duì)應(yīng)的序列，再 把被寄生蛋白質(zhì)序列連接起來(lái)，成為有功能的蛋白質(zhì)，該過(guò)程即蛋白質(zhì)剪接過(guò)程。內(nèi)含膚W其獨(dú)特的蛋白質(zhì)自剪切功能而被廣泛的用于蛋白質(zhì)工程領(lǐng)域。MxeGyrA內(nèi)含膚（來(lái)自 Mycobacteriumxenopi菌），具有198個(gè)氨基酸，經(jīng)突變修飾后在琉基誘導(dǎo)劑的條件下可W 進(jìn)行N端自我切割。New化glandBiol油S公司利用此內(nèi)含膚的特性研發(fā)了pTWIN蛋白純 化系統(tǒng)，用于一步簡(jiǎn)單操作制備與純化目的蛋白。
[0007] 為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供了一種內(nèi)含膚介導(dǎo)的對(duì)重組蛋白進(jìn)行定點(diǎn)聚己二 醇修飾的方法，該方法包含：步驟1，克隆或合成重組蛋白基因片段；步驟2,將重組蛋白基 因片段與MxeGyrA內(nèi)含膚基因片段用重疊PCR技術(shù)連接為重組蛋白基因-GyrA融合基因 片段，并在GyrA基因C端加純化標(biāo)簽，通過(guò)雙酶切構(gòu)建入表達(dá)載體中，并導(dǎo)入宿主細(xì)胞中進(jìn) 行表達(dá)；步驟3,發(fā)酵該宿主細(xì)胞，使其表達(dá)目的融合蛋白，從而獲得包含重組蛋白、內(nèi)含膚 和純化標(biāo)簽的融合蛋白產(chǎn)物；步驟4,在聚己二醇（陽(yáng)G)修飾物NH2-PEG-C00H的氨基端合 成加入一個(gè)半脫氨酸（切S)，并進(jìn)行HPLC純化，得到切S-PEG-C00H的陽(yáng)G活化修飾物；步 驟5,利用所述的純化標(biāo)簽對(duì)步驟3所得的融合蛋白產(chǎn)物進(jìn)行純化，使目的蛋白與樹(shù)脂填料 結(jié)合后，充分洗脫雜蛋白，用切割液buffers快速浸潤(rùn)填料，并將柱子兩端封口后于4°C反 應(yīng)12~24小時(shí)（或者25°C反應(yīng)1~4小時(shí)），然后用buffers沖洗柱子并收集流出液，測(cè) 定樣品中蛋白濃度；步驟6,加入50~100倍重組蛋白摩爾量的切S-PEG-C00H修飾物，室 溫進(jìn)行連接反應(yīng)4~6小時(shí)，將連接后產(chǎn)物經(jīng)陰離子交換柱進(jìn)行純化，去除沒(méi)有反應(yīng)的PEG 修飾物；（可選合并步驟5和6 ;利用所述的純化標(biāo)簽對(duì)步驟3所得的融合蛋白產(chǎn)物進(jìn)行純 化，使目的蛋白與樹(shù)脂填料結(jié)合后，充分洗脫雜蛋白，用5個(gè)柱體積的含有50~100倍重組 蛋白摩爾濃度切S-PEG-C00H修飾物的切割液buffers快速浸潤(rùn)填料，立即將柱子兩端封口 后于4°C反應(yīng)12~24小時(shí)（或者25°C反應(yīng)1~4小時(shí)），然后用不含切S-PEG-C00H修飾 物的buffers沖洗柱子并收集流出液，經(jīng)陰離子交換柱進(jìn)行純化，去除沒(méi)有反應(yīng)的PEG修飾 物。）步驟7,對(duì)PEG修飾的重組蛋白進(jìn)行純化。
[000引上述內(nèi)含膚介導(dǎo)的對(duì)重組蛋白進(jìn)行定點(diǎn)聚己二醇修飾的方法，其中，步驟2所述 的純化標(biāo)簽包含組氨酸標(biāo)簽化s-tag、幾了質(zhì)結(jié)合域C抓等。用基因工程的方法來(lái)表達(dá)蛋白 質(zhì)，必須經(jīng)過(guò)純化才能實(shí)現(xiàn)最終目的，將目的蛋白和一個(gè)親和純化短標(biāo)簽進(jìn)行融合表達(dá)，通 過(guò)親和純化標(biāo)簽蛋白來(lái)純化目的蛋白是常用的間接手段，當(dāng)融合蛋白溶液流經(jīng)親和純化介 質(zhì)時(shí)，融合蛋白由于純化標(biāo)簽的存在會(huì)被特異親和吸附，雜質(zhì)被洗掉后再洗脫目標(biāo)蛋白，即 達(dá)到使目的蛋白純化的目的。
[0009] 上述內(nèi)含膚介導(dǎo)的對(duì)重組蛋白進(jìn)行定點(diǎn)聚己二醇修飾的方法，其中，步驟2中構(gòu) 建的融合蛋白的基因排列方式為重組蛋白基因一MxeGyrA基因一純化標(biāo)簽，所述的融合蛋 白的S部分即重組蛋白基因、MxeGyrA基因、純化標(biāo)簽之間的連接方式包含直接連接化及 借助其它蛋白連接膚連接，MxeGyrA基因核巧酸序列如SeqIDNo. 1所示。
[0010] 上述內(nèi)含膚介導(dǎo)的對(duì)重組蛋白進(jìn)行定點(diǎn)聚己二醇修飾的方法，其中，步驟5所述 的切割液緩沖液 3 化uffer3)，pH為 8. 0,由lOOmMNa&PCVlOmMTris，lO-lOOmM二硫蘇糖 醇值kDithiot虹eitol,DTT)或 2-琉基己燒橫酸鋼（2-mercaptoethanesulfonicacid, MESNA)組成。
[0011] 上述內(nèi)含膚介導(dǎo)的對(duì)重組蛋白進(jìn)行定點(diǎn)聚己二醇修飾的方法，其中，步驟4得到 的切S-PEG-C00H的陽(yáng)G活化修飾物的純度大于90%。陽(yáng)G的分子量大小包括2K，5K，10K， 20K。
[0012] 上述內(nèi)含膚介導(dǎo)的對(duì)重組蛋白進(jìn)行定點(diǎn)聚己二醇修飾的方法，其中，步驟1所述 的重組蛋白基因?yàn)镚eneBank公用數(shù)據(jù)庫(kù)佑enBank:ADA03392. 1)公布的人干擾素a的氨 基酸序列，如Seq ID No. 2所示。進(jìn)行原核表達(dá)系統(tǒng)密碼子偏好性?xún)?yōu)化后，人工合成干擾素 a基因序列如Seq ID No. 3所示。構(gòu)建的融合蛋白的基因排列方式為干擾素a基因一較 鏈區(qū)一Mxe GyrA基因一His標(biāo)簽，其中His-Tag標(biāo)簽是加在GyrA基因的C端，通過(guò)Nde I 與化0I雙酶切構(gòu)建入祀T28a載體中，轉(zhuǎn)化E. coli D冊(cè)a感受態(tài)篩選陽(yáng)性克隆，并進(jìn)行酶 切與基因測(cè)序驗(yàn)證，將構(gòu)建成功的表達(dá)載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E. coli BL2UDE3)菌種感受態(tài)，獲得 表達(dá)菌株。
[0013] 上述內(nèi)含膚介導(dǎo)的對(duì)重組蛋白進(jìn)行定點(diǎn)聚己二醇修飾的方法，其中，步驟