一個與黃瓜單性結(jié)實主效QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記Indel-T-47的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明公開了黃瓜單性結(jié)實主效QTL的分子標(biāo)記，屬于蔬菜分子遺傳育種技術(shù)領(lǐng) 域，可用于黃瓜全雌種質(zhì)的單性結(jié)實能力鑒定及分子標(biāo)記輔助育種。
【背景技術(shù)】
[0002] 黃瓜是我國大面積栽培的主要蔬菜之一，具有極高的社會價值和經(jīng)濟效益。單性 結(jié)實是指子房不經(jīng)過授粉受精或別的刺激而發(fā)育成果實的現(xiàn)象。單性結(jié)實能力強的黃瓜品 種，具有顯著的增產(chǎn)潛力，一般可提高產(chǎn)量20%以上，且單性結(jié)實的果實因無籽，瓜瓢少，果 肉厚，使得品質(zhì)得到提高，商品性好。因此，單性結(jié)實性是與黃瓜產(chǎn)量和品質(zhì)密切相關(guān)的重 要經(jīng)濟性狀，是黃瓜品種選育的目標(biāo)性狀之一，在黃瓜育種中極具利用價值。
[0003] 目前，黃瓜單性結(jié)實材料或品種的選育主要依靠田間束花隔離進行表型鑒定，該 方法不僅耗時長，需要大量的人力和物力，且單性結(jié)實容易受外界條件的影響，表型選擇效 率不高，選育難度大，育成的黃瓜品種存在單性結(jié)實性不穩(wěn)定，易受栽培環(huán)境影響等弊端。 近年來，隨著分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，許多研宄者利用與目標(biāo)性狀QTL連鎖的分子標(biāo)記對種 質(zhì)進行輔助選擇，這一方法不受基因表達和環(huán)境因素的影響，可在早代進行選擇且操作簡 單，很大程度上提高了選擇的速度和準(zhǔn)確性。其中InDel(Insertion/Deletion)分子標(biāo)記 是基于全基因組重測序開發(fā)的標(biāo)記，因其在基因組內(nèi)分布廣、密度大、穩(wěn)定性和多態(tài)率高， 檢測容易且具有共顯性遺傳，重復(fù)性好、對DNA質(zhì)量要求較低等優(yōu)點，可以高效準(zhǔn)確地用于 遺傳圖譜構(gòu)建，利用與目標(biāo)性狀連鎖的分子標(biāo)記進行輔助育種。
[0004] 基于上述目的，本發(fā)明開展了黃瓜單性結(jié)實遺傳機制和單性結(jié)實QTL定位研宄。 以強單性結(jié)實自交系'EC1'為母本，非單性結(jié)實自交系'8419S-1'為父本，構(gòu)建了 F2:3群體 和F4:5剩余雜合體群體（RHL，Residual heterozygous line)，利用F2:3群體對黃瓜單性結(jié) 實主效QTL位點進行定位，利用F4:5剩余雜合體群體對該主效QTL進行驗證，同時結(jié)合雙親 重測序結(jié)果的分析，開發(fā)并篩選與主效QTL位點緊密連鎖的InDel標(biāo)記，以及利用F 3:4群體 和7份全雌黃瓜種質(zhì)材料驗證該標(biāo)記對單性結(jié)實的選擇效果。該標(biāo)記可為黃瓜單性結(jié)實分 子標(biāo)記輔助選擇育種提供新型、高效、實用的分子標(biāo)記。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供與黃瓜單性結(jié)實主效QTL Parth2. 1緊密連鎖的分子標(biāo)記 InDel-T-47,并應(yīng)用這個標(biāo)記進行黃瓜單性結(jié)實種質(zhì)材料的鑒定。
[0006] 本發(fā)明通過以下技術(shù)方案得以實現(xiàn)：
[0007] 黃瓜自交系'EC1'中單性結(jié)實主效QTL Parth2. 1緊密連鎖的分子標(biāo) 記InDel-T-47,其上游引物序列為TCAAACGAAAGGTAAGGAGGAATG，下游引物序列為 AGGCCTGAAGAGAGCTTCAAAGTA 〇
[0008] 本發(fā)明還公開了該引物鑒定黃瓜單性結(jié)實材料的方法，即用該標(biāo)記引物對待鑒定 材料經(jīng)行PCR擴增，擴增出155bp特異條帶的材料，都具有較強的單性結(jié)實能力。
[0009] 上述引物用于鑒定黃瓜種質(zhì)材料單性結(jié)實能力的具體方法為：
[0010] 1.以待鑒定材料的DNA作為模板，用InDel-T-47分子標(biāo)記引物進行PCR擴增；
[0011] 2. PCR擴增反應(yīng)體系組成為：10 Xbuffer (含 Mg2+) 2. 0 y L，dNTP2. 0 y L，正、反向引 物各 1 y L，Taq 酶（5U ? y I71) 0? 25 y L、DNA (10ng) 1. 0 y L，ddH20,12. 75 y L，反應(yīng)總體積為 20 y L。反應(yīng)程序為94°C預(yù)變性5min，每個循環(huán)95°C預(yù)變性30s，60°C退火30S，72°C延伸 lmin 20s，35 個循環(huán)；72°C延伸 5min，10°C保存；
[0012] 3. PCR產(chǎn)物檢測：反應(yīng)產(chǎn)物在7%的非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳，用硝酸銀染 色。電泳結(jié)果如果能擴增出155bp特異條帶的植株為含有Parth2. 1的植株。
[0013] 有益效果：
[0014] 1.本發(fā)明公開的'EC1'中與單性結(jié)實主效QTL Parth2. 1位點緊密連鎖的分子標(biāo) 記引物（InDel-T-47F/InDel-T-47R)是根據(jù)雙親基因組重測序的結(jié)果設(shè)計而成，用來鑒定 植株是否含有Parth2. 1，與已有文獻中公布的ALFP等標(biāo)記相比，方法簡單、方便、擴增穩(wěn) 定。
[0015] 2.標(biāo)記引物InDel-T-47F/InDel-T-47R擴增的產(chǎn)物是Parth2. 1的峰值標(biāo)記，與已 有文獻中公開的分子標(biāo)記相比，本發(fā)明的分子標(biāo)記與Parth2. 1的遺傳距尚更近，利用分子 標(biāo)記輔助選擇Parth2. 1的準(zhǔn)確性更高。
【附圖說明】
[0016] 圖1 :利用F2:3群體進行Parth2. 1定位，白色框和斜紋框分別表示2013年春季和 秋季的檢測結(jié)果。
[0017] 圖2 :利用F4:5RHL群體縮短的Parth2. 1區(qū)段及標(biāo)記Indel-T-47在2號染色體上 的位置
[0018] 注：網(wǎng)紋框表示縮短的Parth2. 1區(qū)段，黑色實心圓點表示Parth2. 1的峰值位置， L0D 值為 9. 1。
[0019] 圖3 :用雙親、強單性結(jié)實、非單性結(jié)實自交系DNA作為模板，用本發(fā)明中的標(biāo)記引 物Indel-T-47F/Indel-T-47R進行PCR擴增，結(jié)果顯示在EC1 (泳道1)和強單性結(jié)實自交 系（泳道4-8)中擴增出155bp的單條帶，而在非單性結(jié)實親本（泳道2)和自交系（泳道 9-10)中均未擴增出相應(yīng)的條帶。
[0020] 注：泳道 1，12 :Marker ;泳道 2 :? EC1 ;泳道 3 :8419s-l ;泳道 4 :F1 ;泳道 5-9 :強單 性結(jié)實自交系；泳道10-11 :非單性結(jié)實自交系
【具體實施方式】
[0021] 在2013年春、秋兩季對"EC1X8419S-1"構(gòu)建的F2:3群體進行了單性結(jié)實表型鑒 定。選用1335對SSR引物和173對InDel引物在'EC1'和'8419S-1'之間進行多態(tài)引物篩 選，然后將232對多態(tài)引物在16個匕單株上繼續(xù)篩選，最終133個SSR引物和9個InDel 引物在145個&單株中進行PCR擴增，用JoinMap4. 0構(gòu)建連鎖圖譜，并用Windows QTL Cartographer v2. 5軟件定位黃瓜單性結(jié)實相關(guān)QTL。結(jié)果顯示，位于2號染色體上的主效 QTL Parth2. 1在兩個環(huán)境中均可被檢測到，可解釋的表型變異率分別為17. 4%和10. 2%。 從F3:4群體中篩選含有Parth2. 1的剩余雜合單株并構(gòu)建F4:5群體。利用該群體對主效區(qū)間 進行標(biāo)記加密，并結(jié)合該群體內(nèi)單株單性結(jié)實的表型鑒定，將Parth2. 1區(qū)段進一步縮短， Indel-T-47是該區(qū)段的峰值標(biāo)記，與Parth2. 1緊密連鎖。
[0022] 1.與Parth2. 1緊密連鎖分子標(biāo)記引物設(shè)計
[0023] 在上述分子標(biāo)記連鎖圖譜構(gòu)建和黃瓜單性結(jié)實主效QTL Parth2. 1發(fā)掘的研宄中， 分子標(biāo)記Indel-T-47是Parth2. 1的峰值標(biāo)記（圖2)。該標(biāo)記引物是通過雙親全基因組重 測序，利用SAMTOOLS軟件檢測長度小于50bp的小片段插入與缺失位點，并根據(jù)該位點上下 游200bp的序列，用Premier 5. 0軟件設(shè)計而成。
[0024]標(biāo)記 Indel-T-47 引物序列為：Indel-T-47F :5'-TCAAACGAAAGGTAAGGAGGAATG-3'， Indel-T-47R :5' -AGGCCTGAAGAGAGCTTCAAAGTA-3'。
[0025] 2.標(biāo)記引物Indel-T-47F/Indel-T-47R在F3:4群體中的分子檢測
[0026] 為了驗證該分子標(biāo)記的準(zhǔn)確性，本實驗室利用Indel-T-47F/Indel-T-47R引物 在F 3:4群體單株中進行PCR擴增檢測，結(jié)合單株的表型鑒定進行卡方測驗，結(jié)果顯示x 2 = 20. 14 > x2a(ll,8= 18. 48,表明Indel-T-47標(biāo)記與單性結(jié)實極顯著相關(guān)。擴增產(chǎn)物含有 155bp特異條帶的植株單性結(jié)實率的平均值極顯著高，于不含該條帶的植株（表1)。
[0027] 表1 Indel-T-47F/Indel-T-47R引物不同基因型植株單性結(jié)實率的顯著性分析
【主權(quán)項】
1. 黃瓜單性結(jié)實主效QTL Parth2. 1的分子標(biāo)記Indel-T-47,其特征在于：該分子標(biāo)記 的引物序列為： Indel-T-47F :5' -TCAAACGAAAGGTAAGGAGGAATG-3， Indel-T-47R :5' -AGGCCTGAAGAGAGCTTCAAAGTA-3' 且Indel-T-47是Parth2. 1的峰值標(biāo)記。
2. 黃瓜單性結(jié)實主效QTL Parth2. 1的分子標(biāo)記方法，其特征包括：以待鑒定材料的 DNA作為模板，用權(quán)利要求1所述的分子標(biāo)記Indel-T-47的引物對進行PCR擴增；對擴增 產(chǎn)物進行聚丙烯酰胺凝膠電泳分離分析；能擴增出155bp特異條帶的植株為含有黃瓜單性 結(jié)實主效QTL Parth2. 1的植株。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的黃瓜單性結(jié)實主效QTL Parth2. 1的分子標(biāo)記方法，其特征在 于包括以下步驟： (1) 以待鑒定材料的DNA為模板，用權(quán)利要求1所述的分子標(biāo)記Indel-T-47的引物 對進行PCR擴增；PCR擴增反應(yīng)的總體系為20yl，包括！IOXbuffer(含Mg2+) 2.0yL， dNTP2.0yL，正、反向引物各IyL，Taq酶（5U. ^1^)0.25yUDNA(IOng)LOyL，ddH20， 12. 75yL。反應(yīng)程序為 94°C預(yù)變性 5min;94°C變性 30s，60°C退火 30S，72°C延伸Imin20s， 35個循環(huán)；72°C延伸5min，10°C保存。 PCR產(chǎn)物檢測：反應(yīng)產(chǎn)物在7%的非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳，用硝酸銀染色。 (2) 標(biāo)記引物鑒定Parth2. 1 :能擴增出155bp特異條帶的植株為含有Parth2. 1的植 株。
4. 權(quán)利要求1所述的分子標(biāo)記在分子標(biāo)記輔助育種中的應(yīng)用。
5. 權(quán)利要求1所述的分子標(biāo)記在鑒定全雌黃瓜種質(zhì)單性結(jié)實能力中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了與單性結(jié)實主效QTL Parth2.1連鎖的分子標(biāo)記方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。首先公開了與QTL Parth2.1緊密連鎖的分子標(biāo)記Indel-T-47，同時公開了該標(biāo)記的引物Indel-T-47F/Indel-T-47R。在含有Parth2.1的分離群體中，該標(biāo)記與單性結(jié)實性顯著相關(guān)。在含有Parth2.1的全雌自交系材料中，標(biāo)記引物Indel-T-47F/Indel-T-47R在強單性結(jié)實株系中均能擴增出155bp產(chǎn)物，是Parth2.1的峰值標(biāo)記，與Parth2.1緊密連鎖。本發(fā)明公開的與Parth2.1緊密連鎖分子標(biāo)記，可用于全雌黃瓜單性結(jié)實分子標(biāo)記輔助育種。
【IPC分類】C12N15-11, C12Q1-68
【公開號】CN104789562
【申請?zhí)枴緾N201510235861
【發(fā)明人】陳勁楓, 武喆, 李季, 錢春桃, 婁群峰, 張璐, 張婷, 李蕾, 張停林
【申請人】南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開日】2015年7月22日
【申請日】2015年5月6日