一種鑒定水稻堊白主效基因的基因型的分子標(biāo)記及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及植物生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，涉及一種鑒定水稻堊白主效基因的基因型的分子標(biāo)記及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]水稻是我國(guó)重要的農(nóng)作物，稻米品質(zhì)直接關(guān)系到水稻生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)效益和人民的生活質(zhì)量。堊白是稻米胚乳中不透明的部分，是我國(guó)稻米外觀品質(zhì)中最重要的衡量指標(biāo)之一。堊白粒率低、無(wú)堊白的稻米具有優(yōu)良的外觀特性；此外，堊白率低的稻米整精米率一般也相應(yīng)較高，碾磨后碎米少，商品價(jià)值高。因此，低堊白水稻品種深受稻米加工企業(yè)和消費(fèi)者的歡迎。水稻堊白性狀受遺傳因素和環(huán)境因素共同控制，其中遺傳因素是影響稻米堊白性狀的主要因素。
[0003]在優(yōu)質(zhì)稻米品種選育過(guò)程中，低堊白特性一直是育種家的重要目標(biāo)。傳統(tǒng)堊白性狀往往需要在水稻成熟獲得一定數(shù)量籽粒后，利用目測(cè)、圖像掃描等方法對(duì)堊白程度進(jìn)行分級(jí)或者計(jì)算。目測(cè)方法由于主觀隨意性大，測(cè)定的靈敏度、準(zhǔn)確性和可重復(fù)性均難以得到保證；而圖像掃描方法比較精確和客觀，但是操作相對(duì)繁瑣和費(fèi)時(shí)，難以在育種早期世代進(jìn)行選擇。因此，利用分子標(biāo)記實(shí)現(xiàn)對(duì)堊白調(diào)控基因直接選擇，是實(shí)現(xiàn)水稻低堊白特性高效選擇的有效手段。
[0004]前人研宄表明，第5號(hào)染色體上編碼液泡膜質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)焦磷酸酶的L0C_0s05g06480，是影響水稻籽粒堊白的形成和精米率等品質(zhì)性狀的關(guān)鍵基因(Li Y, FanC， Xing Y， et al.Chalk5 encodes a vacuolar H+-translocating pyrophosphataseinfluencing grain chalkiness in rice.Nature genetics, 2014)?，F(xiàn)有技術(shù)報(bào)道自然種質(zhì)群體中該位點(diǎn)大致涵蓋7種單體型，系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)的構(gòu)建將這7種單體型歸為兩類(lèi)，并找到若干個(gè)保守的SNP位點(diǎn)。其中，位于該基因的啟動(dòng)子區(qū)域-576位的SNP位點(diǎn)T/C變異具有重要應(yīng)用價(jià)值。因此，對(duì)該SNP位點(diǎn)進(jìn)行基因分型可實(shí)現(xiàn)對(duì)不同堊白特性的分子鑒定，提高在育種早期世代的堊白特性選擇效率。
[0005]傳統(tǒng)SNP位點(diǎn)鑒定通?；跍y(cè)序、酶切或基因芯片進(jìn)行分析，在大量樣品鑒定時(shí)成本較高，難以滿足育種需求。四引物擴(kuò)增受阻PCR (ARMS-PACR)能夠針對(duì)SNP位點(diǎn)進(jìn)行特異等位擴(kuò)增。針對(duì)已知的變異位點(diǎn)，于兩側(cè)分別設(shè)計(jì)I對(duì)外引物和I對(duì)特異性內(nèi)引物，特異性內(nèi)引物3’末端堿基必須落在突變點(diǎn)的位置上，從而選擇性地?cái)U(kuò)增突變型與野生型個(gè)體基因。在同一次擴(kuò)增中野生型和突變型基因產(chǎn)生的擴(kuò)增片段長(zhǎng)度不同，通過(guò)產(chǎn)物片段中特定條帶的有無(wú)判別個(gè)體的基因型，是一種共顯性分型技術(shù)，具有操作簡(jiǎn)便、分型快速、費(fèi)用低廉等優(yōu)勢(shì)。
[0006]ARMS-PCR引物的設(shè)計(jì)是決定該技術(shù)檢測(cè)靈敏度的關(guān)鍵，其次，ARMS-PCR對(duì)SNP檢出率還依賴于反應(yīng)條件的優(yōu)化。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)有技術(shù)中水稻堊白鑒別存在的技術(shù)缺陷，提供一種鑒定水稻堊白主效基因Chalk5基因型的分子標(biāo)記。
[0008]本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供上述分子標(biāo)記在鑒定水稻堊白主效基因Chalk5基因型或/和堊白性狀中的應(yīng)用。
[0009]本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供上述分子標(biāo)記在水稻育種中的應(yīng)用。
[0010]本發(fā)明的第四個(gè)目的是利用上述分子標(biāo)記鑒定水稻堊白性狀或同時(shí)鑒定水稻堊白性狀和水稻堊白主效基因Chalk5基因型的方法。
[0011]本發(fā)明的第五個(gè)目的是利用上述分子標(biāo)記鑒定水稻堊白主效基因Chalk5基因型的方法。
[0012]本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)的:
一種鑒定水稻堊白主效基因Chalk5基因型的分子標(biāo)記Chalk5-T/C，所述分子標(biāo)記由一對(duì)外引物 Chalk5-0-F、Chalk5_0_R 和一對(duì)內(nèi)引物 Chalk5_C_F、Chalk5_T_R 組成，引物序列如SEQ ID NO:1?4所示。
[0013]本發(fā)明所述分子標(biāo)記是針對(duì)堊白基因的啟動(dòng)子SNP位點(diǎn)“-576-T/C”設(shè)計(jì)，該分子標(biāo)記涵蓋差異位點(diǎn)。
[0014]為了增加引物的特異性，本發(fā)明上述引物是利用在線tetra-primer ARMS-PCR引物設(shè)計(jì)工具 Primerl (http://primerl.soton.ac.uk/primerl.html)設(shè)計(jì)得到，同時(shí)，本發(fā)明所述內(nèi)引物的3’端第3個(gè)堿基引入錯(cuò)配堿基。
[0015]提供上述分子標(biāo)記在鑒定水稻堊白主效基因Chalk5基因型或/和水稻堊白性狀中的應(yīng)用。
[0016]提供上述分子標(biāo)記在水稻育種中的應(yīng)用。
[0017]提供利用上述分子標(biāo)記鑒定水稻堊白主效基因Chalk5基因型的方法；具體地，該方法包括以下步驟:
SI待測(cè)樣品DNA提??；
S2以SI得到的樣品DNA為模板，構(gòu)建PCR反應(yīng)體系，利用所述分子標(biāo)記進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
S3利用凝膠電泳或毛細(xì)管電泳分析PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物，進(jìn)行結(jié)果判定，所述結(jié)果判定為:若出現(xiàn)196bp和298bp條帶，則表明待測(cè)樣品的堊白主效基因?yàn)榈蛨装谆蛐?；若出現(xiàn)150bp和298bp條帶，則表明待測(cè)樣品的堊白主效基因?yàn)楦邎装谆蛐?；若出現(xiàn)150bp、196bp和298bp條帶，則表明待測(cè)樣品的堊白主效基因?yàn)殡s合型。
[0018]提供利用上述分子標(biāo)記鑒定水稻堊白性狀或同時(shí)鑒定水稻堊白主效基因Chalk5基因型和水稻堊白性狀的方法，具體地，包括以下步驟:
SI待測(cè)樣品DNA提取；
S2以SI得到的樣品DNA為模板，構(gòu)建PCR反應(yīng)體系，利用所述分子標(biāo)記進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
S3利用凝膠電泳或毛細(xì)管電泳分析PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物，進(jìn)行結(jié)果判定，所述結(jié)果判定為:若出現(xiàn)196bp和298bp條帶，則表明待測(cè)樣品的堊白主效基因?yàn)榈蛨装谆蛐停郎y(cè)樣品為低堊白品種；若出現(xiàn)150bp和298bp條帶，則表明待測(cè)樣品的堊白主效基因?yàn)楦邎装谆蛐?，待測(cè)樣品為高堊白品種；若出現(xiàn)150bp、196bp和298bp條帶，則表明待測(cè)樣品的堊白主效基因?yàn)殡s合型，待測(cè)樣品為中間型品種。
[0019]ARMS-PCR檢測(cè)的靈敏度除了決定于引物的特異性之外，還受到PCR反應(yīng)各種條件的影響，如引物濃度、退火溫度、TaqDNA聚合酶的濃度等，因此，優(yōu)選地，上述方法中，所述 PCR 反應(yīng)體系為:DNA 模板 1.0 uL、Chalk5_C_F 0.5uL、Chalk5_T_R 0.5uL、Chalk5_0_F
0.3uL、Chalk5_0-R 0.3uL、2XPower Taq PCR Master Mix 7.5uL，用雙蒸滅菌水補(bǔ)足至15uL0
[0020]優(yōu)選地，上述方法中，所述PCR擴(kuò)增的條件為:94 °C預(yù)變性5min，94 °C 30s，55°C 30s，72°C 35s共運(yùn)行35個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸1min。
[0021]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果:
本發(fā)明提供了一種鑒定水稻堊白主效基因Chalk5基因型的分子標(biāo)記，該標(biāo)記擴(kuò)增片段適中、特異性強(qiáng)；利用該標(biāo)記鑒定水稻堊白主效基因Chalk5基因型，不需要經(jīng)過(guò)測(cè)序，僅僅通過(guò)簡(jiǎn)單的PCR即可對(duì)水稻堊白主效基因進(jìn)行基因分型，區(qū)分高、低堊白的水稻品種，實(shí)現(xiàn)了對(duì)水稻堊白性狀的分子標(biāo)記輔助選擇，本發(fā)明所述分子標(biāo)記可以用于水稻改良分離群體的分子標(biāo)記輔助選擇，提高育種效率，滿足大規(guī)模分子育種的需求。
【附圖說(shuō)明】
[0022]圖1為Chalk5_T/C引物序列及位置示意圖；其中等位變異位點(diǎn)分別以紅色背景標(biāo)識(shí)，弓I物錯(cuò)配堿基以下劃線標(biāo)識(shí)。
[0023]圖2為Chalk5_T/C擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳分型；其中:1_明恢63 ;2_巴斯馬蒂370 ；
3-珍汕 97B ；4-1R64 ;5_ 珍汕 97B/ 明恢 63。
[0024]圖3為Chalk5_T/C聯(lián)合全自動(dòng)毛細(xì)管電泳檢測(cè)結(jié)果；其中M為DNA ladder ；1?10為檢測(cè)水稻材料，1、3、6為C/C型；2，8、10為T(mén)/T型；4、5、7、9為C/T型。
【具體實(shí)施方式】
[0025]下面結(jié)合說(shuō)明書(shū)附圖和具體實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的簡(jiǎn)單修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍；若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。
[0026]實(shí)施例1水稻堊白基因功能性標(biāo)記Chalk5_T/C的引物設(shè)計(jì)及擴(kuò)增片段分析
1、引物設(shè)計(jì)
針對(duì)堊白基因Chalk5的啟動(dòng)子SNP位點(diǎn)“-576-T/C”( T-高堊白品種，C-低堊白品種)，利用在線 tetra-primer ARMS-PCR 引物設(shè)計(jì)工具 Primerl(http://primerl.soton.ac.uk/primerl.html)設(shè)計(jì)涵蓋差異位點(diǎn)的功能標(biāo)記Chalk5_T/C，同時(shí)在等位特異引物的3’端第3個(gè)堿基處引入錯(cuò)配堿基，增加特異性(圖1)。所述的Chalk5-T/C由4個(gè)引物Chalk5_0_F、Chalk5-0-R、Chalk5-C-F 和 Chalk5_T_R 構(gòu)成，引物序列(5’ _3’)如下:
ChaIk5-0-F:TCAAAAACCACCATTCGAAATGAChalk5-0-R:TGTGTATAAACATTTTTGTTGTTTTTGCAChalk5-C-F:CATTTTCAGTGCGTCCAAAACCChalk5-T-R:AAGTTATATACGGTGCGTCTCATGGA (引物序列中帶下劃線的堿基為引入的錯(cuò)配堿基，加框的堿基為要檢測(cè)的變異堿基)
2、擴(kuò)增片段分析
低堊白基因型(C/C純合型)、高堊白基因型(T/T純合型)和雜合型(C/T雜合型)，都能利用Chalk5-0-F和Chalk5-0-R擴(kuò)增出大小約為298 bp的條帶，此帶可以用于PCR擴(kuò)增與否的監(jiān)測(cè)。此外，低堊白基因型(C/C純合型)還能利用Chalk5-C-F和Chalk5-0-R擴(kuò)增出一條196 bp的條帶；高堊白基因型(T/T純合型)能利用Chalk5-0-F和Chalk5-T-R擴(kuò)增出一條150 bp的條帶；雜合型(C/T雜合型)既能擴(kuò)增出196 bp的條帶又能擴(kuò)增出150 bp的條帶。
[0027]實(shí)施例2利用功能性標(biāo)記Chalk5_T/C分析5個(gè)水稻品種的堊白基因型 1、水稻基因組DNA的提取
以5個(gè)水稻品種為材料:明恢63、巴斯馬蒂370、珍汕97B、IR64、