從豬小腸黏膜肝素提取后廢棄液中制備脫氧核糖核酸的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及從動物組織制備脫氧核糖核酸領(lǐng)域，尤其是一種利用豬小腸黏膜肝素提取后的廢棄液中制備脫氧核糖核酸的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]核酸是生命的最基本物質(zhì)之一，它廣泛存在于所有動物、植物細胞、微生物內(nèi)，生物體內(nèi)核酸常與蛋白質(zhì)結(jié)合形成核蛋白。不同的核酸，其化學組成、核苷酸排列順序等不同。根據(jù)化學組成不同，核酸可分為核糖核酸(簡稱RNA)和脫氧核糖核酸(簡稱DNA)。
[0003]DNA是儲存、復(fù)制和傳遞遺傳信息的主要物質(zhì)，在生物體的個體生長、發(fā)育、繁殖、遺傳等各個環(huán)節(jié)起著重要作用，有促進細胞生長、增強細胞活力及改善機體代謝等作用。隨著人類對DNA研宄的不斷深入，發(fā)現(xiàn)其對眾多重大疾病的治療、治療后恢復(fù)、營養(yǎng)保健等方面有積極的作用，不同生物組織中提取的DNA可用于:(I)增強免疫功能；(2)治療急、慢性肝炎及治療后恢復(fù)；(3)治療白細胞減少癥，包括腫瘤患者放療、化療后的白細胞減少；(4)治療血小板減少癥、貧血及再生障礙性貧血等疾??；(5)治療冠心病、心肌梗塞、心肌炎；
(6)促進大面積創(chuàng)傷的修復(fù)；(7)抗衰老；(8)各種慢性消耗性疾病營養(yǎng)補充等。因此，近年來核酸物質(zhì)需求量很大，如:歐洲對核酸的需求額從2005年6.7億美元增加到2012年的14.9億美元，從事核酸類相關(guān)技術(shù)研宄意義重大，產(chǎn)品的市場需求很大。在核酸制備技術(shù)方面，八十年代前后主要從小牛胸腺和魚類精囊中提取，九十年代后，由于該類貨源緊缺，限制了 DNA的生產(chǎn)；由于生物發(fā)酵法生產(chǎn)DNA技術(shù)難度大、成本很高，近年來從動物廢棄物中提取DNA成為研宄的熱點。如:中國專利(申請?zhí)?200410016960.3)披露了一種從豬、羊、雞和鴨的胸腺中提取脫氧核苷酸方法，惠長野等開展了從豬小腸黏膜中提取脫氧核糖核酸的研宄(沈陽藥科大學學報，2013，30(1):63-67)。
[0004]我國是全球肝素粗品和肝素原料藥的生產(chǎn)大國和出口國，而制取肝素的原料主要以豬小腸黏膜為主。腸粘膜提取肝素后有大量廢棄物產(chǎn)生，廢棄物的排放不僅造成環(huán)境污染，同時廢棄物中具有醫(yī)療保健作用的活性物質(zhì)也被浪費。因此，對廢棄物進行利用，從中提取高附加值的脫氧核糖核酸，不僅能減輕環(huán)境污染，而且可以實現(xiàn)廢棄物的綜合利用，提高經(jīng)濟效益，也是本發(fā)明的意義所在。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]針對脫氧核苷酸提取原料緊缺的現(xiàn)狀，以及豬小腸黏膜肝素提取過程中廢棄物隨意排放、造成資源浪費的現(xiàn)象，本發(fā)明的目的在于提供一種從豬小腸黏膜肝素提取后廢棄液中制備脫氧核糖核酸的方法，該方法可實現(xiàn)豬小腸粘膜綜合利用，提高產(chǎn)品附加值，為脫氧核糖核酸的制備提供新來源，緩解原料短缺的現(xiàn)狀。
[0006]為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是:
[0007]一種從豬小腸黏膜肝素提取后廢棄液中制備脫氧核糖核酸的方法，該方法包括以下步驟:
[0008](I)柱吸附:將離子交換樹脂裝入吸附柱中，用泵將豬小腸黏膜肝素提取后廢棄液通過含有樹脂的吸附柱進行吸附；
[0009](2)脫附:用濃度為0.05?0.2mol/L的氯化鈉洗脫吸附柱，用溫度為60?70°C濃度為2.0?4.0mol/L的氯化鈉溶液洗脫，收集脫附液；
[0010](3)酸沉:將收集的脫附液調(diào)節(jié)pH至I?3，靜置；
[0011](4)復(fù)溶:將(3)中混合液進行離心，收集沉淀，用蒸餾水清洗沉淀2?4次，加入蒸餾水，攪拌下加入堿溶液，使沉淀溶解；
[0012](5)醇沉:加入體積分數(shù)為90%?95%的乙醇進行沉淀，靜置12?24h，去掉上清液，收集下層沉淀；
[0013](6)透析:將(5)中沉淀溶于37?55°C蒸餾水中，轉(zhuǎn)入透析袋中，透析，去除小分子物質(zhì)，透析結(jié)束后，將透析內(nèi)液進行旋蒸濃縮，凍干，獲得脫氧核糖核酸。
[0014]所述的從豬小腸黏膜肝素提取后廢棄液中制備脫氧核糖核酸的方法，該方法所獲得的脫氧核糖核酸的分子量分布范圍為3?70kDa之間。
[0015]所述的從豬小腸黏膜肝素提取后廢棄液中制備脫氧核糖核酸的方法，步驟(I)中，吸附所用的樹脂為羅門哈斯AMBERLITE FPA 98 CL樹脂，豬小腸黏膜肝素提取后廢棄液與樹脂的重量比為700?1200:1ο
[0016]所述的從豬小腸黏膜肝素提取后廢棄液中制備脫氧核糖核酸的方法，步驟(2)中，清洗吸附柱所用0.05?0.2mol/L的氯化鈉溶液體積為吸附柱體積的2?3倍，脫附所用的2.0?4.0mol/L氯化鈉溶液體積為吸附柱體積的1.5?3倍。
[0017]所述的從豬小腸黏膜肝素提取后廢棄液中制備脫氧核糖核酸的方法，步驟(3)中，調(diào)節(jié)脫附液pH值時采用的酸為I?3mol/L的鹽酸，邊攪拌邊加酸，靜置溫度為4?8°C，時間為4?12h。
[0018]所述的從豬小腸黏膜肝素提取后廢棄液中制備脫氧核糖核酸的方法，步驟(4)中，復(fù)溶所采用的堿為I?4mol/L的氫氧化鈉，邊攪拌邊滴加，直至沉淀全部復(fù)溶，溶液pH為6?8。
[0019]所述的從豬小腸黏膜肝素提取后廢棄液中制備脫氧核糖核酸的方法，步驟(5)中，醇沉所用乙醇的體積為復(fù)溶后溶液體積的3?4倍。
[0020]所述的從豬小腸黏膜肝素提取后廢棄液中制備脫氧核糖核酸的方法，步驟(6)中，透析脫鹽所用透析袋或超濾濃縮膜截留分子量為lOOODa，透析時間為12?24h，每隔2?4h換一次水。
[0021]本發(fā)明的優(yōu)點和有益效果為:
[0022](I)本發(fā)明在離子樹脂脫附工藝中先用2?3倍柱體積的0.05?0.2moL/L的氯化鈉清洗。因為脫氧核糖核酸在該鹽濃度范圍內(nèi)溶解度較低，而低濃度的氯化鈉溶液可以去除部分樹脂中的雜質(zhì)。用溫度為60?70°C濃度為2.0?4.0mol/L的氯化鈉溶液進行脫附，是因為在該高鹽濃度下脫氧核糖核酸的溶解度達到最大，且在該溫度下，大多數(shù)雜蛋白質(zhì)會發(fā)生變性，該條件能將脫氧核糖核酸與樹脂中的雜質(zhì)及樣品中的蛋白質(zhì)進行有效分離，獲得較高純度的脫氧核糖核酸。
[0023](2)本發(fā)明將酸沉復(fù)溶所獲得脫氧核糖核酸產(chǎn)品進行醇沉，是根據(jù)脫氧核糖核酸不溶于乙醇溶液，而某些小肽和色素等雜質(zhì)能夠溶于乙醇溶液的特點，利用這一原理，可以將所需脫氧核糖核酸產(chǎn)品進一步純化。
[0024](3)本發(fā)明豬小腸原料豐富、采用的制備和工藝簡單，適合于工業(yè)生產(chǎn)，可彌補市場中脫氧核糖核酸資源不足的缺陷。
[0025](4)本發(fā)明選用豬小腸黏膜肝素提取后的工業(yè)生產(chǎn)后的廢棄液，來源充足，成本低廉，適合規(guī)?；a(chǎn)，所得產(chǎn)品具有重要的市場應(yīng)用前景。
[0026]總之，與現(xiàn)有采用的原料和技術(shù)不同，本發(fā)明所使用的原材料既不是胸腺，也不是豬小腸的黏膜，而是工業(yè)化生產(chǎn)肝素后的廢液；所用的提取技術(shù)既不是表面活性劑和鹽析也不是酶解與鈣離子沉淀，而是離子交換樹脂吸附分離和醇沉技術(shù)，且得到的產(chǎn)品質(zhì)量標準也與其不同；本發(fā)明產(chǎn)品DNA純度高，其磷含量為9.1 %?9.3%，接近于理論值
9.2wt%,尤其本發(fā)明技術(shù)路線簡單，成本低廉，無毒無污染，選用原料為肝素提取后的廢棄液，不僅不影響肝素的提取和肝素的質(zhì)量，而且降低環(huán)境污染，并回收高附加值的DNA產(chǎn)品O
【附圖說明】
[0027]圖1為本發(fā)明脫氧核糖核酸的紫外吸收圖。
[0028]圖2為本發(fā)明脫氧核糖核酸的十八角度激光散射儀分析圖。其中，橫坐標時間單位是分鐘，縱坐標相對標尺的單位是相對空白溶液的折光指數(shù)(ARI)。
[0029]圖3為本發(fā)明脫氧核糖核酸的紅外光譜圖。
【具體實施方式】
[0030]在【具體實施方式】中，本發(fā)明所提供脫氧核糖核酸的制備方法，將豬小腸黏膜肝素提取后廢棄液進行柱吸附，然后進行脫附，收集脫附液調(diào)PH，醇沉、脫水、干燥，具體工藝步驟如下:
[0031](I)柱吸附:將離子交換樹脂裝入吸附柱中，用泵將豬小腸黏膜肝素提取后廢棄液通過吸附柱進行吸附；
[0032](2)脫附:用濃度為0.05?0.2mol/L的氯化鈉清洗吸附柱，排凈后，用溫度為60?70°C濃度為2.0?4.0moI/L的氯化鈉溶液洗脫，收集脫附液；
[0033](3)酸沉:將收集起的脫附液調(diào)節(jié)pH至I?3，靜置，沉淀；
[0034](4)復(fù)溶:離心，去除上清，沉淀用蒸餾水清洗三遍，去除沉淀表面殘留的上清液，加入蒸餾水，緩慢滴加堿溶液使沉淀復(fù)溶。
[0035](5)醇沉:加入體積分數(shù)為90%?95%的乙醇進行沉淀，靜置12?24h，去掉上清液，收集下層沉淀；
[0036](6)透析:將醇沉所得沉淀溶于37?55°C蒸餾水中，轉(zhuǎn)入透析袋中，透析，去除鹽等小分子物質(zhì)，透析結(jié)束后，將透析內(nèi)液旋蒸濃縮，凍干，獲得寡聚脫氧核糖核酸。所述脫氧核糖核酸的分子量分布范圍為3?70kDa之間，凝膠滲透色譜檢測洗脫峰單一對稱，含有少量核糖核酸，其重量百分含量為I %?3%。
[0037]步驟⑴中，二次吸附所用的樹脂為羅門哈斯AMBERLITE FPA 98 CL樹脂，豬小腸黏膜肝素提取后廢棄液與樹脂的重量比為700?1200:1。步驟(2)中，清洗吸附柱所用0.05?0.2mol/L的氯化鈉溶液體積為吸附柱體積的2?3倍，脫附所用的2.0?4.0mol/L的氯化鈉溶液體積為吸附柱體積的1.5?3倍。步驟(3)中，調(diào)節(jié)脫附液pH值時采用的酸為3mol/L的鹽酸，邊攪拌邊加酸，靜置溫度為4?8°C，時間為4?12h。步驟(4)中，復(fù)溶所采用的堿為2mol/L的氫氧化鈉，邊攪拌邊滴加，直至沉淀全部復(fù)溶，此時，溶液pH約為6?8。步驟(5)中，醇沉所用的體積為復(fù)溶后溶液體積的3?4倍。步驟(6)中，透析所用的透析袋截留分