一種豬胸主動(dòng)脈中提取水不溶性膠原蛋白的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物制品領(lǐng)域，尤其是涉及一種以豬胸主動(dòng)脈為原料，通過脫脂、除 雜、酶解、鹽析、透析等工藝步驟制備水不溶性膠原蛋白的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 膠原蛋白主要存在于動(dòng)物結(jié)締組織中，是哺乳動(dòng)物體內(nèi)含量最多、分布最廣的功 能性蛋白，對(duì)機(jī)體和臟器起著支撐、保護(hù)、結(jié)合和界隔等作用，在關(guān)節(jié)潤滑、組織形成及成 熟、凝血作用、傷口愈合、細(xì)胞間信號(hào)傳遞、運(yùn)載生物因子和衰老等方面都起著舉足輕重的 作用。
[0003] 膠原蛋白在工業(yè)中廣泛應(yīng)用于化妝品、食品、保健品中，此外，由于膠原蛋白的低 免疫源性、止血作用、可促進(jìn)細(xì)胞增殖和細(xì)胞生長、可生物降解且降解產(chǎn)物無毒副作用等諸 多優(yōu)點(diǎn)，被越來越多的應(yīng)用到組織工程中，例如人工皮膚、傷口敷料、人工骨骼、人造腱以及 人造血管等多種生物材料。
[0004] 目前獲得膠原蛋白的主要途徑是從畜禽類動(dòng)物組織以及海洋生物中提取分離，且 主要產(chǎn)物為水溶性膠原蛋白。該類膠原不能在水體系中成型，并且在體內(nèi)環(huán)境中，極易被降 解。盡管可通過化學(xué)交聯(lián)來改性膠原材料，卻降低了膠原材料使用的安全性。此外，常規(guī)提 取對(duì)原料的堿處理或高溫處理，會(huì)對(duì)原料中膠原蛋白成分造成破壞，并且水溶性這一特性 使得純化過程繁瑣。
[0005] 我國是養(yǎng)豬大戶，除了供應(yīng)日常食用需求，目前豬皮已被回收提取膠原，小腸用來 提取具有抗凝血活性的肝素鈉以外，其余成分均被遺棄，沒有得到更好的利用，浪費(fèi)資源又 污染環(huán)境。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的上述問題，本發(fā)明提供一種豬胸主動(dòng)脈中提取水不溶性膠原 蛋白的方法。本發(fā)明方法充分利用了工業(yè)廢料豬血管，實(shí)現(xiàn)了變廢為寶，且工藝步驟簡單安 全并易于操作、產(chǎn)品純度高。
[0007] 本發(fā)明的技術(shù)方案如下：取檢疫合格的豬，無菌開腔取胸主動(dòng)脈，冷凍干燥粉碎。 經(jīng)丙酮低溫脫脂、鹽酸胍或尿素低溫去除蛋白聚糖等雜質(zhì)后，再經(jīng)胃蛋白酶酶解后，繼續(xù)用 鹽析法獲得水不溶性膠原蛋白粗品沉淀。沉淀用醋酸溶液重新溶解后，逐步對(duì)醋酸溶液和 蒸餾水透析，所得沉淀冷凍干燥后既得水不溶性膠原蛋白產(chǎn)品。
[0008] 本發(fā)明有益的技術(shù)效果在于：
[0009] 1、本發(fā)明方法中豬胸主動(dòng)脈預(yù)處理后經(jīng)低溫有機(jī)熔劑脫脂、表面活性劑去除蛋白 聚糖的步驟，達(dá)到了初步脫脂去除雜質(zhì)的效果。
[0010] 2、本發(fā)明方法所得膠原蛋白不溶于水，與現(xiàn)有技術(shù)生產(chǎn)出的產(chǎn)品相比，純化過程 簡單，且產(chǎn)品純度高。
[0011] 3、本發(fā)明方法整個(gè)生產(chǎn)工藝中的酸性條件，避免了堿性環(huán)境對(duì)膠原蛋白的變性作 用，不改變原料中膠原蛋白的性質(zhì)，保持了其原有的生物活性，因此本發(fā)明制得的膠原蛋白 具有很好的生物活性，安全可靠，無毒副作用。且與現(xiàn)有技術(shù)生產(chǎn)出的水溶性膠原蛋白產(chǎn)品 相比較，降解速率大幅度降低，延長了作用時(shí)間，凝血速度更快，可滿足機(jī)體自修復(fù)要求。
[0012] 4、本發(fā)明方法以豬胸主動(dòng)脈為原料，成本低，所需設(shè)備簡單，提取剩余殘?jiān)€可作 為生產(chǎn)飼料繼續(xù)使用，充分利用了資源，又降低了環(huán)境污染，生產(chǎn)過程中用有機(jī)試劑低溫脫 月旨，有效去除脂類成分，蛋白變性劑去除蛋白聚糖后，酶降解法提取膠原蛋白，再用鹽析法 沉淀膠原蛋白，最后經(jīng)逐步透析冷凍干燥得到水不溶性膠原蛋白。
[0013] 6、本發(fā)明方法包括預(yù)處理、脫脂、除雜、酶解、鹽析、重溶、透析、冷凍干燥的工藝步 驟，按照工藝順序進(jìn)行，各步驟相輔相承，共同配合完成膠原蛋白的提取，缺一不可。
【具體實(shí)施方式】
[0014] 下面結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體描述。
[0015] 實(shí)施例1
[0016] -種豬胸主動(dòng)脈中提取水不溶性膠原蛋白的方法，包括如下步驟：
[0017] (1)預(yù)處理：采用檢疫合格的豬，無菌開腔，取胸主動(dòng)脈，剔除表面結(jié)締組織后，用 無菌水漂洗干凈后，冷凍干燥，粉碎至100目；
[0018] (2)脫脂：將步驟（1)粉碎的胸主動(dòng)脈，置于丙酮試劑中，于-20°c條件下攪拌12h 后，5000r/min的轉(zhuǎn)速下，離心30min，去除乳白色上清液，更換新丙酮試劑重復(fù)上述脫脂操 作，直至上清液呈清亮透明狀，去除上清液，將下層產(chǎn)品置于真空干燥箱風(fēng)干；
[0019] (3)除雜：在步驟（2)所得下層產(chǎn)品中，加入產(chǎn)品重量10倍體積的4M鹽酸胍溶液， 于4°C條件下攪拌72h后，8000r/min的轉(zhuǎn)速下，離心30min，去除上清液后，下層產(chǎn)品經(jīng)蒸 餾水漂洗2次至上清液為中性，8000r/min的轉(zhuǎn)速下，離心30min，去除上清液，保留下層產(chǎn) 品；
[0020] (4)酶解：在步驟⑶所得下層產(chǎn)品中，加入液料比為50mL/g的0. 5M醋酸溶液， 再加入產(chǎn)品重量0. 05倍的胃蛋白酶，于37°C條件下反應(yīng)30h后，8000r/min的轉(zhuǎn)速下，離心 30min，去除下層沉淀，保留上清液；
[0021] (5)鹽析：常溫?cái)嚢锠顟B(tài)下在步驟⑷制得的上清液中，加入粉末狀NaCl至飽和， 8000r/min的轉(zhuǎn)速下，離心20min，去除上清液，保留沉淀物；
[0022] (6)重溶：將步驟（5)離心所得的沉淀物用0. 5M醋酸溶液溶解，8000r/min的轉(zhuǎn)速 下，離心20min，去除不溶物，保留上清液；
[0023] (7)透析：將步驟（6)制得的上清液，在0. 5M醋酸溶液中對(duì)截留分子量為HOOODa 的透析袋透析3d后，再在0.1 M醋酸溶液中透析3d，最后在蒸餾水中透析至置換液為中性；
[0024] (8)冷凍干燥：將步驟（7)所得的透析產(chǎn)物，在8000r/min的轉(zhuǎn)速下，離心30min， 去除上清液，收集沉淀物并冷凍干燥，即得水不溶性膠原蛋白。
[0025] 實(shí)施例2
[0026] 一種豬胸主動(dòng)脈中提取水不溶性膠原蛋白的方法，包括如下步驟：
[0027] (1)預(yù)處理：采用檢疫合格的豬，無菌開腔，取胸主動(dòng)脈，剔除表面結(jié)締組織后，用 無菌水漂洗干凈后，冷凍干燥，粉碎至70目；
[0028] (2)脫脂：將步驟（1)粉碎的胸主動(dòng)脈，置于丙酮試劑中，于_20°C條件下攪拌12h 后，5000r/min的轉(zhuǎn)速下，離心30min，去除乳白色上清液，更換新丙酮試劑重復(fù)上述脫脂操 作，直至上清液呈清亮透明狀，去除上清液，將下層產(chǎn)品置于真空干燥箱風(fēng)干；
[0029] (3)除雜：在步驟（2)所得下層產(chǎn)品中，加入產(chǎn)品重量12倍體積的4M鹽酸胍溶液， 于4°C條件下攪拌72h后，8000r/min的轉(zhuǎn)速下，離心30min，去除上清液后，下層產(chǎn)品經(jīng)蒸 餾水漂洗3次至上清液為中性，8000r/min的轉(zhuǎn)速下，離心30min，去除上清液，保留下層產(chǎn) 品；
[0030] (4)酶解：在步驟（3)所得下層產(chǎn)品中，加入液料比為80mL/g的0. 5M醋酸溶液， 再加入產(chǎn)品重量0. 05倍的胃蛋白酶，于37°C條件下反應(yīng)24h后，8000r/min的轉(zhuǎn)速下，離心 30min，去除下層沉淀，保留上清液；
[0031] (5)鹽析：常溫?cái)嚢锠顟B(tài)下在步驟⑷制得的上清液中，加入粉末狀NaCl至飽和， 8000r/min的轉(zhuǎn)速下，離