一種檢測(cè)生物濾床對(duì)胞外微囊藻毒素降解潛能的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于吸附材料技術(shù)領(lǐng)域。更具體地，涉及一種樹(shù)枝狀高密度固態(tài)胺纖維材 料及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 微囊藻毒素（Microcystins，簡(jiǎn)稱MCs)是一種肝毒素，在藻華水體中普片存在，短 期大量攝入會(huì)引起死亡，長(zhǎng)期飲用也會(huì)引發(fā)肝癌等癥狀。目前，微囊藻毒素已發(fā)現(xiàn)超過(guò)80 多種構(gòu)型，最常見(jiàn)也是影響最大的是MC-LR、MC-RR和MC-YR這三種，其中MC-LR是分布最 廣，影響最大的一種微囊藻毒素。微囊藻毒素一般產(chǎn)生并存在于藻細(xì)胞體內(nèi)，但在一定條件 下，藻細(xì)胞會(huì)破裂，胞內(nèi)藻毒素（MC)會(huì)釋放到水體中，成為溶解態(tài)的胞外毒素（EMC)，嚴(yán)重 威脅飲用水安全。
[0003] 目前，針對(duì)微囊藻毒素的去除方法已經(jīng)有許多種，根據(jù)其去除原理可粗略分為物 理法、化學(xué)法、生物法3大類，比較常見(jiàn)如氣浮、活性炭吸附、臭氧氧化、Fenton氧化等。物理 法大部分通過(guò)去除微囊藻細(xì)胞從而去除胞內(nèi)藻毒素（IMC)，但對(duì)水體中的胞外毒素（EMC) 的去除效果并不理想，且容易使藻細(xì)胞破裂，增加水體中的胞外毒素?；瘜W(xué)方法主要通過(guò)氧 化作用破壞MCs的結(jié)構(gòu)，大部分對(duì)胞內(nèi)、胞外毒素均有較好的處理效果，但化學(xué)藥劑的大量 使用容易產(chǎn)生有毒有害副產(chǎn)物，帶來(lái)二次污染，且處理成本極高，難以大規(guī)模應(yīng)用。自然曝 氣生物濾床是在傳統(tǒng)濾床的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的，其占地面積小，運(yùn)行成本低、處理快速、且 對(duì)胞外毒素和胞內(nèi)毒素均與較高的去除效率，有著很好的應(yīng)用前景。
[0004] 研宄指出，生物濾床基質(zhì)中微生物的降解作用是生物濾床去除胞外微囊藻毒素的 主要途徑?；|(zhì)表面掛膜形成的生物膜降解菌群落對(duì)溶解態(tài)的胞外毒素的去除具有十分重 要的作用。然而，目前大部分濾床為不斷添加富營(yíng)養(yǎng)水體進(jìn)行自然掛膜，而常規(guī)手段無(wú)法對(duì) 生物膜的形成狀況及基質(zhì)中的微囊藻毒素降解菌豐度進(jìn)行檢測(cè)評(píng)估，因而往往需要進(jìn)行長(zhǎng) 期掛膜，以盡量確保生物膜的形成穩(wěn)定，生物濾床能達(dá)到較好的去除效果，不僅浪費(fèi)大量的 人力和資源，而其對(duì)生物濾床的掛膜狀況也無(wú)法準(zhǔn)確評(píng)估。現(xiàn)有技術(shù)中，小規(guī)模裝置大多通 過(guò)人工配置含微囊藻毒素進(jìn)水或在微囊藻水華時(shí)檢測(cè)裝置對(duì)微囊藻毒素的去除率從而對(duì) 裝置去除能力進(jìn)行衡量。然而，人工配置大量微囊藻毒素進(jìn)水操作麻煩，且成本昂貴，無(wú)法 大規(guī)模使用。而在水華期間進(jìn)行檢測(cè)去除率也無(wú)法達(dá)到提前準(zhǔn)備的作用，對(duì)水質(zhì)安全無(wú)法 保證。傳統(tǒng)的COD檢測(cè)法可以在一定程度上衡量裝置生物膜的發(fā)育是否穩(wěn)定，但無(wú)法專一 針對(duì)微囊藻毒素降解菌進(jìn)行檢測(cè)，評(píng)估結(jié)果準(zhǔn)確度較差。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)有檢測(cè)生物濾床降解潛能技術(shù)的缺陷和不足， 提供一種簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確、可靠、靈敏度高的檢測(cè)生物濾床的降解潛能的方法。
[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種檢測(cè)生物濾床對(duì)胞外微囊藻毒素降解潛能的方法。
[0007] 本發(fā)明另一目的是提供上述檢測(cè)生物濾床對(duì)胞外微囊藻毒素降解潛能的方法的 應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明上述目的通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)： 一種檢測(cè)生物濾床對(duì)胞外微囊藻毒素降解潛能的方法，是通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法 檢測(cè)生物濾床基質(zhì)中的微囊藻毒素降解菌的豐度，從而間接評(píng)估生物濾床對(duì)微囊藻毒素的 降解能力，步驟如下： 51. 采集生物濾床表層的基質(zhì)； 52. 震蕩過(guò)濾提取基質(zhì)生物膜上的微生物； 53. 快速提取微生物的DNA ; 54. 通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)微囊藻毒素降解菌基因 mlrA的拷貝數(shù)； 55. 通過(guò)mlrA及微囊藻毒素降解效率間的關(guān)系曲線評(píng)估生物濾床對(duì)微囊藻毒素的降 解能力。
[0009] 具體地，上述檢測(cè)生物濾床對(duì)胞外微囊藻毒素降解潛能的方法包括如下步驟： 51. 生物濾床基質(zhì)樣品采集與處理：采集生物濾床表層I. 0~5. Ocm處的基質(zhì)，加入到 TE緩沖液中，震蕩清洗15~30min后，取出懸濁液，向剩余基質(zhì)中再次添加 TE緩沖液，震蕩 清洗15min，取出懸濁液； 52. 過(guò)濾：將Sl處理后得到的所有懸濁液依次用孔徑I. 0 μπι的玻璃纖維微孔濾膜A (25mmX I. 0 μπι)和孔徑0· 22 μπι的玻璃纖維微孔濾膜B (25mmX0. 22 μπι)進(jìn)行過(guò)濾(過(guò)濾 所用濾膜均為玻璃纖維微孔濾膜直徑為25mm，面積較小，方面后續(xù)步驟的操作，如較易塞進(jìn) 含玻璃小珠的I. 5mL離心管中）； 53. 樣品DNA提?。簩⒑袠悠返臑V膜B輕輕塞進(jìn)含有玻璃珠的離心管中，用液氮反復(fù) 凍融后，進(jìn)行DNA提取(濾膜上的微生物細(xì)胞經(jīng)過(guò)液氮凍融法和玻璃小珠法共同作用，細(xì)胞 破碎更充分）； 54. 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)：以提取的樣品DNA為模板，用引物qmlrAf和qmlrAr進(jìn)行 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，所述引物qmlrAf和qmlrAr的序列分別如SEQ ID NO. 1~2所示； 55. 根據(jù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)得到的拷貝數(shù)來(lái)判斷生物濾床對(duì)胞外微囊藻毒素的降 解潛能。
[0010] 更具體地，上述檢測(cè)生物濾床對(duì)胞外微囊藻毒素降解潛能的方法的步驟如下： 51. 生物濾床基質(zhì)樣品采集與處理 SI 1.采集生物濾床表層I. 0~5. Ocm處的基質(zhì)10~30g，加入到已添加100~200mL TE緩沖液的玻璃瓶(如藍(lán)蓋玻璃血清瓶）中，28°C，280r/min震蕩15~30min后，取出懸濁 液； S12.向Sll剩余基質(zhì)中添加50~IOOmL TE buffer，震蕩15min取出懸濁液； 該步驟Sl (微生物）基質(zhì)樣品采集與處理過(guò)程中，在恒溫振蕩器中清洗2次(第一次添 加100-200mL TE緩沖液，第二次添加50-100mL TE緩沖液)，能夠保證充分提取微生物，避 免殘留； 52. 過(guò)濾： 521. 將Sl處理后得到的所有懸濁液用孔徑1.0 μπι的玻璃纖維微孔濾膜A (25mmX I. 0 μ m)進(jìn)行過(guò)濾，濾膜A再經(jīng)CldH2O沖洗3~5次并抽濾干凈； 522. 收集S21的濾液，再次通過(guò)孔徑0· 22 μπι的玻璃纖維微孔濾膜B(25mmX0. 22 μπι) 過(guò)濾；（過(guò)濾所用濾膜均為玻璃纖維微孔濾膜直徑為25mm，面積較小，方面后續(xù)步驟的操 作，如較易塞進(jìn)含玻璃珠的I. 5mL離心管中）； 53. 樣品DNA提?。簩⒑袠悠返臑V膜B輕輕塞進(jìn)I. 5mL離心管中，并用液氮反復(fù)凍融 3~5次，回溫后再將濾膜塞進(jìn)含玻璃珠的2mL離心管中，添加提取緩沖液，高速渦旋5min， 進(jìn)行DNA提?。?所述提取緩沖液為：〇. IM磷酸鹽緩沖液，0.1 M Na2EDTA，0.1 M Tris-HC1，1.5M NaCl， 1%CTAB ； 54. 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)：以提取的樣品DNA為模板，用引物qmlrAf和qmlrAr進(jìn)行 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，所述引物qmlrAf和qmlrAr的序列分別如SEQ ID NO. 1~2所示； 55. 根據(jù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)得到的拷貝數(shù)來(lái)判斷生物濾床對(duì)胞外微囊藻毒素的降 解潛能(實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)得到的拷貝數(shù)可以換算成降解菌的細(xì)胞數(shù)，進(jìn)而判斷生物 濾床的降解潛能；拷貝數(shù)越多，降解菌的細(xì)胞數(shù)就越多，濾床的降解潛能就越高)。
[0011] 其中，優(yōu)選地，步驟Sl所述采集是在基質(zhì)表層設(shè)置4~10個(gè)采集點(diǎn)，采集點(diǎn)在基 質(zhì)表層平面上均勻分布，各采集點(diǎn)采集的樣品進(jìn)行混合；所述基質(zhì)為粒徑I. 0~3. Ocm的火 山石、陶?；蚍惺瓤紫堵瘦^大，易附著微生物的自然材料。
[0012] 更優(yōu)選地，步驟Sl是在生物濾床表層I. 0~3. Ocm采集基質(zhì)，采集量為10~20g。
[0013] 另外，優(yōu)選地，步驟S1所述生物濾床為模塊式自然曝氣生物濾床(如附圖1所示)， 垂直方向共分為5層，上面四層為基質(zhì)填充層，填充基質(zhì)為火山石、陶粒或沸石，最下面一 層為循環(huán)進(jìn)水層；每層均設(shè)置采樣口，方便基質(zhì)采集，每層模塊間為跌水曝氣層；另外還設(shè) 置有流量控制器、出水口、每層底部圓篩出水口、裝置底部布水管、頂部進(jìn)水管； 所述模塊式自然曝氣生物濾床的基質(zhì)為粒徑I. 〇~3. Ocm的火山石、陶?；蚍惺茸?然材料； 步驟Sl所述采集是通過(guò)預(yù)設(shè)采樣口從每層基質(zhì)填充層的表層采集基質(zhì)，每層基質(zhì)設(shè) 置采集點(diǎn)4~10個(gè)，采集點(diǎn)在基質(zhì)表層平面上均勻分布，同一層各采集點(diǎn)采集的樣品進(jìn)行 混合。
[0014] 只采集各層表層基質(zhì)是為了減少