經(jīng)修飾的人輪狀病毒及其用圖
【專利說明】
[0001] 遞交數(shù)據(jù)
[0002] 本申請與于2012年8月27日提交的標(biāo)題為"Modified human rotaviruses and uses therefor"的澳大利亞臨時專利申請No. 2012903702相關(guān)，并要求其優(yōu)先權(quán)，其全部內(nèi) 容均通過引用并入本文。
技術(shù)領(lǐng)域
[0003] 本公開內(nèi)容總體上涉及病毒疫苗領(lǐng)域。具體地，本公開內(nèi)容提供了一種經(jīng)修飾的 人輪狀病毒毒株和產(chǎn)生高滴度病毒的培養(yǎng)方法、輪狀病毒疫苗、疫苗接種方案以及診斷和 預(yù)后測定。
【背景技術(shù)】
[0004] 本說明書中參考的任何現(xiàn)有技術(shù)不是且不應(yīng)被認(rèn)為是承認(rèn)或以任何形式暗示該 現(xiàn)有技術(shù)形成了任何國家中公知常識的一部分。
[0005] 作者在本說明書中引用的出版物的目錄細(xì)節(jié)按字母順序收錄在說明書結(jié)尾處。
[0006] 在世界范圍內(nèi)，輪狀病毒（RV)是嬰幼兒中腹瀉相關(guān)的發(fā)病率和死亡率的主 要原因。RV感染每年導(dǎo)致超過500,000人死亡，主要在發(fā)展中國家。世界衛(wèi)生組織 (World Health Organization，WHO)已聲明，當(dāng)務(wù)之急是開發(fā)安全且有效的疫苗（Bern 和 Glass(1994)Impact of diarrheal diseases worldwide In Kapikian AZ(ed)Viral Infections of the grastrointestinal tract，第 2 版，New York Marcel Dekker, Inc.： 1-26 Jiang 等（2002)Clin Infect Dis 34 ;1351-1361)〇
[0007] 特別地，RV導(dǎo)致急性胃腸炎，這是一種需要嬰幼兒住院治療的疾病。在美國、澳大 利亞和日本的研宄已證明34%至63%因急性腹瀉病而住院治療的兒童與RV感染相關(guān)。據(jù) 估計，在美國健康保障組織中進(jìn)行住院治療的RV胃腸炎的發(fā)病率在13至24月齡的兒童中 為十萬分之222,而在小于1歲的兒童中為十萬分之362。在該兒科群體中，RV感染與因急 性腹瀉而導(dǎo)致的全部住院治療的63%有關(guān)。對美國1973至1983年的死亡率數(shù)據(jù)的綜述表 明在小于4歲的兒童中，每年有500例腹瀉病導(dǎo)致的死亡，并且在美國，20%至80%因腹瀉 而導(dǎo)致的過多冬季死亡與RV感染相關(guān)。在第三世界國家中，RV還導(dǎo)致相當(dāng)大比例與腹瀉 病相關(guān)的死亡率。因此，在世界發(fā)達(dá)區(qū)域和發(fā)展中區(qū)域兩者中，有效的RV疫苗對兒童的健 康具有重要影響。
[0008] RV是未包膜的二十面體病毒，其衣殼由三個病毒蛋白（VP)同心層形成。最內(nèi)層 由60個VP2二聚體以及分別為12個拷貝的VPl (RV聚合酶）和VP3(病毒加帽酶（copping enzyme))形成，所述VP2二聚體圍繞由11條雙鏈RNA片段構(gòu)成的病毒基因組。第二層蛋白 質(zhì)由280個VP6的三聚體形成，其位于VP2的頂部，形成雙層顆粒（DLP)。最后，向DLP添加 280個糖蛋白VP7的三聚體和60個VP4蛋白的二聚體刺突用以形成代表成熟感染性RV的 三層顆粒（TLP)。所述VP7構(gòu)成RV的最外層。
[0009] VP7是一種外衣殼蛋白。VP7是一種糖蛋白并且與VP4和VP6相互作用。另一組 蛋白質(zhì)為"非結(jié)構(gòu)蛋白"（NSP)。例如，已經(jīng)提出，NSP5與NSP2 -起在裝配病毒粒質(zhì)和病毒 復(fù)制方面具有結(jié)構(gòu)性作用。
[0010] Sato 等（1981)Arch Virol. 69 :155-160 描述了使用 MA104 細(xì)胞（來自獼猴的胎 腎細(xì)胞）的滾動培養(yǎng)物成功培養(yǎng)了來自糞便樣品的人RV。然而，MA104細(xì)胞是相對未被表 征的，至少在用于作為產(chǎn)生疫苗之病毒的載體時。需要開發(fā)用于在充分表征的細(xì)胞系統(tǒng)中 培養(yǎng)RV的方案以用于開發(fā)RV疫苗。還需所述病毒具有足夠的滴度以在對象中產(chǎn)生保護(hù)性 免疫應(yīng)答。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 核苷酸和氨基酸序列通過序列標(biāo)識號（SEQ ID NO)而被提及。SEQ ID NO在數(shù)值 上與序列標(biāo)識符<400>1(SEQ ID N0:1)、〈400>2(SEQ ID N0:2)等相對應(yīng)。序列標(biāo)識符的 總結(jié)提供于表1中。序列表提供在權(quán)利要求書之后。
[0012] 提供了 Vero細(xì)胞中的輪狀病毒（RV)培養(yǎng)方法。提及的"Vero細(xì)胞"包括Vero細(xì) 胞來源的細(xì)胞系。將RV稱為"Vero適應(yīng)性（Vero-adapted) "RV或"RV3-Vero"或"RV3BB"。 所述方法涉及對RV接種物進(jìn)行胰蛋白酶消化以及在Vero細(xì)胞中培養(yǎng)經(jīng)胰蛋白酶消化的 RV。與其他RV生產(chǎn)中使用的方法相比，本胰蛋白酶方法使用高得多濃度的胰蛋白酶來激 活病毒以使RV3能夠在Vero細(xì)胞中生長。提及的"胰蛋白酶消化"指用來自任何來源的胰 蛋白酶處理RV，所述胰蛋白酶包括豬胰蛋白酶、反芻動物（例如牛）胰蛋白酶和重組胰蛋 白酶的一種或更多種。一旦適應(yīng)在連續(xù)細(xì)胞系中生長，則RV物質(zhì)經(jīng)歷基因組修飾，所述基 因組修飾被方便地鑒定為結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白之一或兩者（包括VP1、VP3、VP4、NSP4、 呢卩5/6)中推導(dǎo)的氨基酸改變和/或￥?1、￥?3、￥?4、呢?2、呢?4和/或呢?5/6中的核苷酸 改變。本公開內(nèi)容還構(gòu)想導(dǎo)致其他RV蛋白中氨基酸改變或?qū)е翿V基因組中核苷酸改變的 遺傳修飾。已提出，Vero適應(yīng)性RV可用于開發(fā)疫苗。還提出了診斷和預(yù)后測定來監(jiān)測RV 感染、疫苗完整性和/或治療方案或預(yù)防方案的有效性。
[0013] 因此，提供了 Vero細(xì)胞適應(yīng)性（"Vero適應(yīng)性"）RV (也稱為RV-Vero或Vero-RV 或RV3BB或Vero適應(yīng)性RV3BB)，與MA104適應(yīng)性RV中的相應(yīng)蛋白質(zhì)相比，其在VP1、VP3、 VP4、NSP4 和 / 或 NSP5/6 中和 / 或編碼 VP1、VP3、VP4、NSP2、NSP4 和 / 或 NSP5/6 之基因中 包含突變。
[0014] 為了方便起見，參照由 Rippinger 等（2010) Virology 405 (I) :1201-1213 公開的 MA104適應(yīng)性RV3序列進(jìn)行了核苷酸和氨基酸比較。
[0015] 還構(gòu)想了在Vero細(xì)胞中培養(yǎng)RV的方法，所述方法包括使用相對于其他RV活化方 案更高濃度的胰蛋白酶使RV的接種物或等分試樣被胰蛋白酶消化。然后，在存在Vero細(xì) 胞的情況下，在足以導(dǎo)致VP1、VP3、VP4、NSP4和/或NSP5/6的氨基酸和/或編碼VP1、VP3、 VP4、NSP2、NSP4和/或NSP5/6的基因之一或兩者至少一個發(fā)生例如當(dāng)與MA104適應(yīng)性RV 相比改變的遺傳修飾的時間和條件下，培養(yǎng)RV。如上所述，胰蛋白酶可來自任何來源，例如 豬胰蛋白酶、反芻動物胰蛋白酶或重組胰蛋白酶。反芻動物胰蛋白酶包括來自牛（bovine)、 綿羊（ovine)、山羊（caprine)、長頸鹿、牦牛、駱蛇（camelus)、大羊蛇（llama)、鈴羊或袋鼠 (macropod)的胰蛋白酶。在一個實施方案中，胰蛋白酶為豬胰蛋白酶、牛胰蛋白酶、綿羊胰 蛋白酶、山羊胰蛋白酶、駱駝胰蛋白酶或重組胰蛋白酶。
[0016] 在一個實施方案中，氨基酸或核苷酸改變發(fā)生在NSP4中選自53、76、85、162和165 的密碼子、NSP5/6中選自46和112的密碼子、VPl中選自886的密碼子、VP3中選自643和 785的密碼子以及VP4中選自43、374、385、388、442和756