五價(jià)輪狀病毒疫苗抗原血清型的檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及五價(jià)輪狀病毒疫苗抗原血清型的檢測方法，通過提取樣品總RNA，應(yīng)用一步法RT-PCR擴(kuò)增樣品中不同血清型的輪狀病毒RNA，進(jìn)行血清型的鑒別，其中包括5對寡聚核苷酸引物（SEQ?ID?No.1-10），分別針對五價(jià)輪狀病毒疫苗中G1血清型、G2血清型、G3血清型、G4血清型和G9血清型抗原擴(kuò)增得到特異性單一條帶PCR產(chǎn)物，產(chǎn)物大小分別為337bp、425bp、326bp、253bp、570bp，無交叉反應(yīng)。本發(fā)明的方法具有靈敏度高、特異性好、快速簡便等特點(diǎn)，可以準(zhǔn)確檢測五價(jià)輪狀病毒疫苗中抗原血清型并且判斷病毒樣品中是否存在混雜現(xiàn)象，主要應(yīng)用于五價(jià)輪狀病毒疫苗開發(fā)過程中毒種純度的監(jiān)測。
【專利說明】五價(jià)輪狀病毒疫苗抗原血清型的檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及分子生物學(xué)檢測技術(shù)，具體地說，涉及五價(jià)輪狀病毒疫苗抗原血清型的檢測方法。
【背景技術(shù)】 [0002]輪狀病毒(Rotavirus，RV)是呼腸孤病毒的一個(gè)屬，其基因組包含11個(gè)片段的雙鏈RNA (dsRNA)病毒，目前已知輪狀病毒可分為7個(gè)組(A~G)，其中A輪狀病毒是引起嬰幼兒腹瀉的主要病原體，全球每年約有45~65萬5歲以下兒童死于輪狀病毒性腹瀉。VP7和VP4是A組輪狀病毒外殼的兩個(gè)蛋白，能刺激宿主機(jī)體刺激產(chǎn)生中和抗體，是病毒中和作用相關(guān)抗原，準(zhǔn)確對其血清型和血清型進(jìn)行鑒定對于A輪狀病毒疫苗研究具有重要意義。根據(jù)VP7和VP4的不同，A組RV被分為21個(gè)G血清型和35個(gè)P血清型，其中至少11個(gè)G型和12個(gè)P型為人RV0目前，全球有5種RV主要流行株，即GlP [8]、G2P [4]、G3P [8]、G4P[8]、G9P[8]。
[0003]RV初始感染主要引起同型特異抗體反應(yīng)，再次感染可引起同型和異型交叉抗體反應(yīng)。由于其特殊的節(jié)段性基因組結(jié)構(gòu)，不同株RV在動物、人體內(nèi)或體外組織培養(yǎng)中共感染時(shí)，可發(fā)生基因重配。此為發(fā)展多價(jià)重配疫苗的分子基礎(chǔ)。
[0004]人-牛五價(jià)重配輪狀病毒疫苗分別以編碼人輪狀病毒5個(gè)主要血清型G1、G2、G3、G4和G9作為VP7單基因替換的親本毒株，其余10個(gè)基因都來自牛輪狀病毒(UK株)，由此構(gòu)建了以牛輪狀病毒為骨架的五價(jià)基因重配疫苗。這些單基因重配體被設(shè)計(jì)為DXUK (Gl型)、DSl XUK (G2 型)、PXUK (G2 型)、ST3XUK (G4 型)和 AU32XUK (G9 型)，五個(gè)單基因重配體聯(lián)合應(yīng)用即為涵蓋人輪狀病毒主要G型(G1、G2、G3、G4和G9型)的五價(jià)基因重配減毒疫苗。
[0005]近年來通過多重聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)，即在同一反應(yīng)體系中加入兩種或兩種以上引物，通過PCR擴(kuò)增檢測多種目的基因，其擴(kuò)增的特異性和效率與單一 PCR相當(dāng)，但同時(shí)可擴(kuò)增針對不同模板的多個(gè)靶序列，是一種簡便、快速的方法，尤其適合于抗原分型檢測。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供五價(jià)輪狀病毒疫苗抗原血清型的檢測方法。
[0007]為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明首先提供用于RT-PCR檢測五價(jià)輪狀病毒疫苗抗原血清型的引物對，所述引物對選自引物對I~5中的至少一種:
[0008]弓丨物對1:以輪狀病毒Gl血清型VP7基因?yàn)榘谢虻囊飳?br> [0009]上游引物5' -CTGTAGCATTATTTGCTTTGAC-3'
[0010]下游引物5' -CATATCTAATTCAAGACTTTGG-3'；
[0011]引物對2:以輪狀病毒G2血清型VP7基因?yàn)榘谢虻囊飳?br> [0012]上游引物5' -TAACAGCACCATTTGTAAGG-3'[0013]下游引物5' -ACAAACTTTTACCGTGCAGTC-3'；
[0014]引物對3:以輪狀病毒G3血清型VP7基因?yàn)榘谢虻囊飳?br> [0015]上游引物5' -AGTTATACTGTCACCACTCCTT-3'
[0016]下游引物5' -TTTCCAGTTGCAGTGTAGCG-3'；
[0017]引物對4:以輪狀病毒G4血清型VP7基因?yàn)榘谢虻囊飳?br> [0018]上游引物5' -ACTTAGATTCGTTTCTGGTGAG-3'
[0019]下游引物5' -TGCCAGTTTTTCGCTATCA-3'；[0020]引物對5:以輪狀病毒G9血清型VP7基因?yàn)榘谢虻囊飳?br> [0021]上游引物5' -CTCCTTTTGCTTATCGTCATTG-3'
[0022]下游引物5' -TACCACTAAGTTTTCACTTGCG-3'。
[0023]優(yōu)選地，本發(fā)明的用于RT-PCR檢測五價(jià)輪狀病毒疫苗抗原血清型的引物對為引物對I~5。
[0024]本發(fā)明還提供含有上述引物對的用于RT-PCR檢測五價(jià)輪狀病毒疫苗抗原血清型的試劑盒。優(yōu)選地，所述試劑盒還包括dNTPs、RNA逆轉(zhuǎn)錄酶、RNase抑制劑、Taq DNA聚合酶、Mg2+、PCR反應(yīng)緩沖液等中的至少一種。更優(yōu)選地，所述試劑盒還包括標(biāo)準(zhǔn)陽性模板。
[0025]本發(fā)明進(jìn)一步提供五價(jià)輪狀病毒疫苗抗原血清型的檢測方法，其是利用上述引物對或試劑盒對待測五價(jià)輪狀病毒疫苗抗原血清型進(jìn)行RT-PCR檢測。
[0026]所述方法包括以下步驟:1)提取樣品中的RNA ;2)以步驟I)中提取的RNA為模板，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)；3)分析擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0027]RT-PCR反應(yīng)體系以50 μ L計(jì)為:
[0028]IOx One Step RNA PCR 緩沖液5μΙ
MgCl21()μ?
dNTP混合物5pL
RIStase抑制劑IpL
AMVRTaseXLIpL
AMV-Optimized Taq DNA 聚合晦ΙμΙ
I.游引物IpL
下游引擒IrL
模板RNAI μ￡
不含 RNase _ dH2Q24pL
[0029]RT-PCR反應(yīng)程序?yàn)?50°C反轉(zhuǎn)錄15min ;94°C預(yù)變性2min ;94°C變性5s，60°C退火30s，72。。延伸40s，共30個(gè)循環(huán)。
[0030]優(yōu)選地，以輪狀病 毒RNA為模板，同時(shí)加入所述5對寡聚核苷酸引物，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。優(yōu)選地，所述的寡聚核苷酸引物在PCR反應(yīng)體系中的摩爾濃度均為5mol/L。
[0031]本發(fā)明可以使用TaKaRa —步法RT-PCR試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增。
[0032]本發(fā)明中涉及的五價(jià)輪狀病毒疫苗來源于分別將人源親本毒株(D、DS-U P、ST3、AU32)的VP7基因整合到牛源親本(UK)中而得到的人牛重配毒株。
[0033]本發(fā)明針對D、DS-1、P、ST3和AU32的VP7基因設(shè)計(jì)特異性引物，利用多重逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)，建立了只需一步即可檢測輪狀病毒樣品中G血清型的方法，在疫苗研發(fā)過程中可實(shí)時(shí)監(jiān)測是否出現(xiàn)混雜現(xiàn)象。
[0034]本發(fā)明提供一種鑒別五價(jià)輪狀病毒疫苗中抗原血清型的方法。通過提取樣品總RNA，應(yīng)用一步法RT-PCR擴(kuò)增樣品中不同血清型的輪狀病毒RNA，進(jìn)行血清型的鑒別，其中包括5對寡聚核苷酸引物(SEQ ID N0.1-10)，分別針對五價(jià)輪狀病毒疫苗中Gl血清型、G2血清型、G3血清型、G4血清型和G9血清型抗原擴(kuò)增得到特異性單一條帶PCR產(chǎn)物，產(chǎn)物大小分別為337bp、425bp、326bp、253bp、570bp，無交叉反應(yīng)。本發(fā)明的方法具有靈敏度高、特異性好、快速簡便等特點(diǎn)，可以準(zhǔn)確檢測五價(jià)輪狀病毒疫苗中抗原血清型并且判斷病毒樣品中是否存在混雜現(xiàn)象，主要應(yīng)用于五價(jià)輪狀病毒疫苗開發(fā)過程中毒種純度的監(jiān)測?！緦＠綀D】

【附圖說明】
[0035]圖1為本發(fā)明實(shí)施例2中利用5對特異性鑒別引物分別對Gl血清型輪狀病毒樣品的RT-PCR擴(kuò)增；其中，1表示Gl血清型鑒別引物；2表示G2血清型鑒別引物；3表示G3血清型鑒別引物；4表示G4血清型鑒別引物；5表示G9血清型鑒別引物。
[0036]圖2為本發(fā)明實(shí)施例2中利用5對特異性鑒別引物分別對G2血清型輪狀病毒樣品的RT-PCR擴(kuò)增；其中，1表示Gl血清型鑒別引物；2表示G2血清型鑒別引物；3表示G3血清型鑒別引物；4表示G4血清型鑒別引物；5表示G9血清型鑒別引物。
[0037]圖3為本發(fā)明實(shí)施例2中利用5對特異性鑒別引物分別對G3血清型輪狀病毒樣品的RT-PCR擴(kuò)增；其中，1表示Gl血清型鑒別引物；2表示G2血清型鑒別引物；3表示G3血清型鑒別引物；4表示G4血清型鑒別引物；5表示G9血清型鑒別引物。
[0038]圖4為本發(fā)明實(shí)施例2中利用5對特異性鑒別引物分別對G4血清型輪狀病毒樣品的RT-PCR擴(kuò)增；其中，1表示Gl血清型鑒別引物；2表示G2血清型鑒別引物；3表示G3血清型鑒別引物；4表示G4血清型鑒別引物；5表示G9血清型鑒別引物。
[0039]圖5為本發(fā)明實(shí)施例2中利用5對特異性鑒別引物分別對G9血清型輪狀病毒樣品的RT-PCR擴(kuò)增；其中，1表示Gl血清型鑒別引物；2表示G2血清型鑒別引物；3表示G3血清型鑒別引物；4表示G4血清型鑒別引物；5表示G9血清型鑒別引物。
[0040]圖6為本發(fā)明實(shí)施例2中利用5對特異性鑒別引物對五價(jià)輪狀病毒疫苗中Gl血清型、G2血清型、G3血清型、G4血清型和G9血清型抗原擴(kuò)增的結(jié)果；其中，1_5分別表示Gl、G2、G3、G4和G9血清型抗原。
[0041]圖7為本發(fā)明實(shí)施例2中利用5對特異性鑒別引物分別對未接毒正常細(xì)胞的RT-PCR擴(kuò)增；其中，1表示Gl血清型鑒別引物；2表示G2血清型鑒別引物；3表示G3血清型鑒別引物；4表示G4血清型鑒別引物；5表示G9血清型鑒別引物。
【具體實(shí)施方式】
[0042]以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例均按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件，如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(Sambrook J&RussellDff, Molecular clon1ng:a laboratory manual, 2001),或按照制造廠商說明書建議的條件。
[0043]以下實(shí)施例中涉及的所有輪狀病毒毒株均由美國國立衛(wèi)生研究院(N1H)提供。
[0044]實(shí)施例1用于RT-PCR檢測五價(jià)輪狀病毒疫苗抗原血清型的引物對的設(shè)計(jì)
[0045]檢索GenBank上的輪狀病毒(D株、DS-1株、P株、ST3株、AU32株)VP7基因序列，應(yīng)用DNASTAR軟件進(jìn)行比對分析，分別找到特異性保守區(qū)，以保守區(qū)為靶目標(biāo)，用引物設(shè)計(jì)軟件Pr1mer5.0，設(shè)計(jì)5對特異性引物)，引物方向均為5’ _3’，具體如下:
[0046](1)以輪狀病毒D株(Gl型)VP7基因?yàn)榘谢虻囊飳?
[0047]上游引物(SEQ1D N0.1):CTGTAGCATTATTTGCTTTGAC
[0048]下游引物(SEQ1D N0.2):CATATCTAATTCAAGACTTTGG
[0049]預(yù)計(jì)擴(kuò)增產(chǎn)物長度為337bp ；
[0050](2)以輪狀病毒DS-1株(G2型)VP7基因?yàn)榘谢虻囊飳?
[0051]上游引物(SEQ1D N0.3):TAACAGCACCATTTGTAAGG
[0052]下游引物(SEQ1D N0.4):ACAAACTTTTACCGTGCAGTC[0053]預(yù)計(jì)擴(kuò)增產(chǎn)物長度為425bp ；
[0054](3)以輪狀病毒P株(G3型)VP7基因?yàn)榘谢虻囊飳?
[0055]上游引物(SEQID N0.5):AGTTATACTGTCACCACTCCTT
[0056]下游引物(SEQID N0.6):TTTCCAGTTGCAGTGTAGCG
[0057]預(yù)計(jì)擴(kuò)增產(chǎn)物長度為326bp ；
[0058](4)以輪狀病毒ST3株(G4型)VP7基因?yàn)榘谢虻囊飳?
[0059]上游引物(SEQID N0.7):ACTTAGATTCGTTTCTGGTGAG
[0060]下游引物(SEQID N0.8):TGCCAGTTTTTCGCTATCA
[0061]預(yù)計(jì)擴(kuò)增產(chǎn)物長度為253bp ；
[0062](5)以輪狀病毒AU32株(G9型)VP7基因?yàn)榘谢虻囊飳?
[0063]上游引物(SEQID N0.9):CTCCTTTTGCTTATCGTCATTG
[0064]下游引物(SEQID N0.10):TACCACTAAGTTTTCACTTGCG
[0065]預(yù)計(jì)擴(kuò)增產(chǎn)物長度為570bp。
[0066]實(shí)施例2引物對的特異性檢測
[0067]1、病毒RNA的提取
[0068]使用Axygen公司的總RNA小量制備試劑盒。按試劑盒說明書，分別從如下病毒樣品中提取RNA (以未接種病毒的正常細(xì)胞凍融液為陰性對照):G1血清型輪狀病毒株(批號:20120821)、G2血清型輪狀病毒毒株(批號:20121208)、G3血清型輪狀病毒株(批號:20130328)、G4血清型輪狀病毒株(批號:20130508)、G9血清型輪狀病毒株(批號:20130722)。
[0069]2、單對引物的特異性檢測
[0070](1)Gl型鑒別引物的特異性檢測
[0071]使用TaKaRa One Step RNA PCR Kit (AMV)，以Gl型鑒別引物分別對步驟一獲得的5個(gè)血清型輪狀病毒的RNA進(jìn)行一步法RT-PCR擴(kuò)增，以步驟一獲得的正常細(xì)胞凍融液的RNA為陰性對照，反應(yīng)體系和反應(yīng)程序如下:
[0072]50 μ L反應(yīng)體系為:
[0073]
【權(quán)利要求】
1.用于RT-PCR檢測五價(jià)輪狀病毒疫苗抗原血清型的引物對，其特征在于，所述引物對選自引物對I~5中的至少一種: 引物對1:以輪狀病毒Gl血清型VP7基因?yàn)榘谢虻囊飳? 上游引物 5' -CTGTAGCATTATTTGCTTTGAC-3' 下游引物 5' -CATATCTAATTCAAGACTTTGG-3'； 引物對2:以輪狀病毒G2血清型VP7基因?yàn)榘谢虻囊飳? 上游引物 5' -TAACAGCACCATTTGTAAGG-3'
下游引物 5' -ACAAACTTTTACCGTGCAGTC-3'； 引物對3:以輪狀病毒G3血清型VP7基因?yàn)榘谢虻囊飳? 上游引物 5' -AGTTATACTGTCACCACTCCTT-3' 下游引物 5' -TTTCCAGTTGCAGTGTAGCG-3'； 引物對4:以輪狀病毒G4血清型VP7基因?yàn)榘谢虻囊飳? 上游引物 5' -ACTTAGATTCGTTTCTGGTGAG-3' 下游引物 5' -TGCCAGTTTTTCGCTATCA-3'； 引物對5:以輪狀病毒G9血清型VP7基因?yàn)榘谢虻囊飳? 上游引物 5' -CTCCTTTTGCTTATCGTCATTG-3' 下游引物 5' -TACCACTAAGTTTTCACTTGCG-3'。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的引物對，其特征在于，所述引物對為引物對I~5。
3.含有權(quán)利要求1或2所述引物對的用于RT-PCR檢測五價(jià)輪狀病毒疫苗抗原血清型的試劑盒。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括dNTPs、RNA逆轉(zhuǎn)錄酶、RNase抑制劑、Taq DNA聚合酶、Mg2+、PCR反應(yīng)緩沖液中的至少一種。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括標(biāo)準(zhǔn)陽性模板。
6.五價(jià)輪狀病毒疫苗抗原血清型的檢測方法，其特征在于，其是利用權(quán)利要求1或2所述引物對，或權(quán)利要求3-5任一項(xiàng)所述試劑盒對待測五價(jià)輪狀病毒疫苗抗原血清型進(jìn)行RT-PCR 檢測。
7.根據(jù)權(quán)利要6所述的方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)提取樣品中的RNA； 2)以步驟I)中提取的RNA為模板，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)； 3)分析擴(kuò)增產(chǎn)物。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，RT-PCR反應(yīng)體系以50μ L計(jì)為:IOx One Step RNA PCR 緩沖液5p.L
MgCI2_L
dNTP混合物5fiL
RNase抑制劍IpL
AMYRTaseXLΙμ? AMV-Optimized Taq DNA 聚合酶Iμ?
上游引物IpL
下游引物Ιμ?
模板RNAIgL不含 RNase 的 dH2024μU`
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，RT-PCR反應(yīng)程序?yàn)?50°C反轉(zhuǎn)錄15min ；94°C預(yù)變性2min ;94°C變性5s，60°C`退火30s，72°C延伸40s，共30個(gè)循環(huán)。
【文檔編號】C12N15/11GK103642940SQ201310646174
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2013年12月4日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月4日
【發(fā)明者】宋菲菲, 付作申, 郝洪吉, 張艷紅, 陳旭, 張曉雪 申請人:北京民海生物科技有限公司