一種羊膜上皮細胞分離、培養(yǎng)的方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種羊膜上皮細胞分離、培養(yǎng)的方法。
【背景技術】
[0002] 圍產期廢棄的羊膜組織是重要的再生醫(yī)學種子細胞來源之一，其來源廣泛、易 于獲取且無倫理道德爭議，是近年的研宄熱點。羊膜中可分離出羊膜上皮細胞（human amnioticepithelialcell,hAEC)和羊膜間充質干細胞（humanamnioticmesenchymal stemcell，hAMSC)，兩種干細胞均具有含量豐富、免疫原性低、無致瘤性等特點是未來臨床 治療的主要干細胞資源，其中羊膜上皮細胞具有更多的"干性"，更為接近胚胎干細胞的性 質，因此成為再生醫(yī)學領域研宄熱點。
[0003]羊膜上皮細胞在受精后第8天由外胚層發(fā)育而來，襯于羊膜內表面，大部分為單 層立方和柱狀細胞，參與羊水形成和傳遞，還可合成、分泌和形成基底膜細胞外間質成分。 研宄顯示，羊膜上皮細胞同樣具有一定三胚層分化潛能，表達多種與胚胎干細胞相關的表 面標志：SSEA3/4、TRAl_60/81、Nanog、0ct4、Sox2等，可在體外特定的誘導條件下可分化成 肝細胞、心肌樣細胞、神經細胞、成骨及軟骨細胞，而且免疫原性低，具有抗炎作用。羊膜上 皮細胞還分泌生理水平的與損傷修復有關的細胞因子，如血小板源性生長因子、血管內皮 細胞生長因子、血管生成因子、轉化生長因子0 2、金屬蛋白酶組織抑制劑1和金屬蛋白酶 組織抑制劑2。這些細胞因子能夠促進種細胞增殖，減少炎癥反應，調節(jié)損傷修復的許多關 鍵步驟。臨床前研宄顯示人羊膜上皮細胞在治療神經組織退化疾病、心肌組織損傷、糖尿病 等疾病模型中有顯著作用，證明在組織修復領域羊膜上皮細胞具有重要的醫(yī)療價值。
[0004] 目前常規(guī)羊膜上皮細胞的分離方法采用0. 25%胰酶一次或多次消化法，由于羊膜 間充質干細胞的胰酶消化效率比羊膜上皮細胞更高，往往會對羊膜上皮細胞造成污染，導 致純度下降。同時羊膜組織極薄，而且柔軟、黏連，不易操作，裝在離心管或無菌瓶中進行胰 酶消化常常折疊、堆積在一起，細胞消化后也很難擺脫羊膜組織，導致羊膜組織中細胞的過 度留存。同時羊膜背面有粘液、血漬和多余的結締組織等物質會影響胰酶消化效率，降低羊 膜上皮細胞的產出，但消化時間（目前比較普遍的多次胰酶消化法總消化時間在30-50min 左右）的過度延長又會導致細胞貼壁率下降、增殖分化能力降低，表面抗原標記丟失。專利 CN201410050051 (人胎盤亞全能干細胞及其干細胞庫構建方法）和CN201310650384 ( -種 從人羊膜中制取干細胞的方法）中采用胰酶分步消化，想達到提高羊膜上皮細胞純度的目 的，但事實表明消化后羊膜組織往往堆積懸浮于溶液中黏附、包裹住大量的羊膜上皮細胞， 因此需要用生理鹽水或D-Hanl's平衡液多次反復沖洗，這樣造成了羊膜間充質干細胞的 大量溢出，降低了羊膜上皮細胞純度。CN201410050051(人胎盤亞全能干細胞及其干細胞庫 構建方法）在羊膜剝離后采用載玻片去除羊膜背面血管、結締組織，碾壓作用會直接破壞 羊膜上皮細胞，且長時間操作導致羊膜上皮細胞活性降低。

【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明是要解決現有方法分離、培養(yǎng)的羊膜上皮細胞的純度低的問題，提供了一 種羊膜上皮細胞分離、培養(yǎng)的方法。
[0006] 本發(fā)明一種羊膜上皮細胞分離、培養(yǎng)的方法，是按以下步驟完成的：
[0007] -、羊膜組織分離和消毒：將羊膜自胎盤上剝離，然后用生理鹽水沖洗2~3遍，再 在含有1%~3%頭孢哌酮的生理鹽水中浸泡3~lOmin ;
[0008] 二、羊膜上皮細胞分離：將羊膜裁剪成50~150cm2的塊狀，然后將裁剪后的羊膜 的上皮面朝上貼敷于無菌硝酸纖維膜上，向培養(yǎng)皿A中加入3~10mL生理鹽水，再將羊膜 的上皮面朝下貼置在培養(yǎng)皿A中，靜置2~3min，獲得羊膜貼片；將羊膜貼片置于培養(yǎng)皿B 中，加入10~30ml質量濃度為0. 25 %的胰酶-EDTA消化15~20min，然后封口膜封口后將 培養(yǎng)皿放入恒溫搖床中消化，得到消化液，再加入2~5ml胎牛血清終止酶反應，然后去除 羊膜貼片上團聚、黏連的羊膜上皮細胞，再將羊膜貼片轉移至裝有生理鹽水的培養(yǎng)皿C中， 清洗貼壁的羊膜上皮細胞，得到清洗液，收集消化液和清洗液，經100目細胞篩過濾，獲得 羊膜上皮細胞單細胞懸液；
[0009] 三、羊膜上皮細胞純化培養(yǎng)：將步驟二獲得的羊膜上皮細胞單細胞懸液在4°C、 1500rpm的條件離心5~15min，棄上清，然后加入含有表皮生長因子的低糖DMEM/F12培養(yǎng) 基重懸細胞，混勻后按0. 9~1.lX105/cm2的接種量接種于培養(yǎng)瓶中，再置于37°C、0)2體 積濃度為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞融合率達到85%后，棄除非貼壁細胞，并用生理鹽水沖 洗2次，然后加入質量濃度為0. 05 %的胰酶-EDTA消化，37°C消化2~5min，棄除消化液， 再用生理鹽水沖洗1~2次，然后加入質量濃度為0. 25%的胰酶-EDTA，在37°C條件下消化 3~6min，再加入FBS終止酶反應，收集消化液，將消化液在4°C、1500rpm旋轉震蕩的條件 下離心5~15min，棄上清，然后加入DMEM/F12培養(yǎng)基重懸細胞，得到高純度P0代羊膜上皮 細胞單細胞懸液，即完成。
[0010] 本發(fā)明的有益效果有：
[0011] (一）羊膜組織制成羊膜貼片后可以保證羊膜上皮面平整，同時羊膜背面粘液與 結締組織與硝酸纖維膜緊密貼合，促進胰酶消化效率和細胞與組織的分離，短時間消化即 可收集全部羊膜上皮細胞，避免了細胞貼壁率的降低。
[0012] (二）羊膜上皮細胞附著于羊膜表面基底膜外側，可以優(yōu)先與組織分離，羊膜背面 與硝酸纖維膜貼合阻礙了羊膜組織中間質細胞的流出，操作中羊膜組織不需要大幅度攪動 也可使羊膜上皮細胞與羊膜組織充分分離，進一步降低了羊膜間充質干細胞的污染。
[0013](三）短時間培養(yǎng)后使用0.05%胰酶，37°C消化2-5min可使羊膜間充質干細胞 完全分離，此時羊膜上皮細胞尚保持平展貼壁狀態(tài)，純化后，加入0. 25%胰酶，37°C消化 3-6min即可獲得高純度羊膜上皮細胞。
【附圖說明】
[0014]圖1為試驗1制備的pi代羊膜上皮細胞形態(tài)的顯微鏡圖；
[0015] 圖2為試驗1制備的P1代羊膜間充質干細胞形態(tài)的顯微鏡圖；
[0016] 圖3為試驗1對照組pi代羊膜上皮細胞形態(tài)的顯微鏡圖；
[0017]圖4為試驗1制備的pi代羊膜上皮細胞中Cytokeratinl9免疫熒光表達圖 (X100)；
[0018] 圖5為試驗1制備的pi代羊膜上皮細胞中DAPI免疫熒光表達圖（X100);
[0019] 圖6為試驗1制備的pi代羊膜上皮細胞Cytokeratinl9和DAPI免疫熒光表達整 合圖（X100);
[0020] 圖7為試驗1制備的pi代羊膜上皮細胞中Cytokeratinl9免疫熒光表達圖 (X200)；
[0021] 圖8為試驗1制備的pi代羊膜上皮細胞中DAPI免疫熒光表達圖（X200);
[0022] 圖9為試驗1制備的pi代羊膜上皮細胞Cytokeratinl9和DAPI免疫熒光表達整 合圖（X200)。
【具體實施方式】
【具體實施方式】 [0023] 一：本實施方式一種羊膜上皮細胞分離、培養(yǎng)的方法，是按以下步驟 完成的：
[0024] 一、羊膜組織分離和消毒：將羊膜自胎盤上剝離，然后用生理鹽水沖洗2~3遍，再 在含有1%~3%頭孢哌酮的生理鹽水中浸泡3~lOmin;
[0025] 二、羊膜上皮細胞分離：將羊膜裁剪成50~150cm2的塊狀，然后將裁剪后的羊膜 的上皮面朝上貼敷于無菌硝酸纖維膜上，向培養(yǎng)皿A中加入3~10mL生理鹽水，再將羊膜 的上皮面朝下貼置在培養(yǎng)皿A中，靜置2~3min，獲得羊膜貼片；將羊膜貼片置于培養(yǎng)皿B 中，加入10~30ml質量濃度為0. 25 %的胰酶-EDTA消化15~20min，然后封口膜封口后將 培養(yǎng)皿放入恒溫搖床中消化，得到消化液，再加入2~5ml胎牛血清終止酶反應，然后去除 羊膜貼片上團聚、黏連的羊膜上皮細胞，再將羊膜貼片轉移至裝有生理鹽水的培養(yǎng)皿C中， 清洗貼壁的羊膜上皮細胞，得到清洗液，收集消化液和清洗液，經100目細胞篩過濾，獲得 羊膜上皮細胞單細胞懸液；
[0026] 三、羊膜上皮細胞純化培養(yǎng)：將步驟二獲得的羊膜上皮細胞單細胞懸液在4°C、 1500rpm的條件離心5~15min，棄上清，然后加入含有表皮生長因子的低糖DMEM/F12培養(yǎng) 基重懸細胞，混勻后按0. 9~1.lX105/cm2的接種量接種于培養(yǎng)瓶中，再置于37°C、0)2體 積濃度為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞融合率達到85%后，棄除非貼壁細胞，并用生理鹽水沖 洗2次，然后加入質量濃度為0. 05 %的胰酶-EDTA消化，37°C消化2~5min，棄除消化液， 再用生理鹽水沖洗1~2次，然后加入質量濃度為0. 25%的胰酶-EDTA，在37°C條件下消化 3~6min，再加入FBS終止酶反應，收集消化液，將消化液在4°C、1500rpm旋轉震蕩的條件 下離心5~15min，棄上清，然后加入DMEM/F12培養(yǎng)基重懸細胞，得到高純度P0代羊膜上皮 細胞單細胞懸液，即完成。
[0027] 本實施方式的有益效果有：
[0028]( -）羊膜組織制成羊膜貼片后可以保證羊膜上皮面平整，同時羊膜背面粘液與 結締組織與硝酸纖維膜緊密貼合，促進胰酶消化效率和細胞與組織的分離，短時間消化即 可收集全部羊膜上皮細胞，避免了細胞貼壁率的降低。
[0029](二）羊膜上皮細胞附著于羊膜表面基底膜