專利名稱：一種人角膜上皮細(xì)胞系的構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于角膜細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種人角膜上皮細(xì)胞系的構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
角膜上皮層(印ithelial layer)作為角膜的第一道屏障，是由5-7層鱗狀細(xì)胞、 翼狀細(xì)胞和柱狀細(xì)胞構(gòu)成的厚約50-60 μ m的結(jié)構(gòu)，不僅具有支撐和穩(wěn)定淚膜的作用，而且還可以有阻止角膜水分的散失和外界病原體的入侵。在角膜上皮層的三種細(xì)胞中，柱狀細(xì)胞是唯一具有分裂能力的細(xì)胞，并可向上分化產(chǎn)生翼狀細(xì)胞和鱗狀細(xì)胞，向下分化產(chǎn)生基底膜，而柱狀細(xì)胞更新及再生的源泉為位于角膜緣基底層的角膜緣干細(xì)胞。目前研究顯示， 臨床上很多嚴(yán)重的眼表疾病如重度的外傷(化學(xué)傷、熱燒傷等)，Stevens Johnson綜合征和眼瘢痕性類天皰瘡等由于角膜緣干細(xì)胞受到損傷或缺失而使角膜上皮失去再生和修復(fù)能力，而最終致盲。此外還有很多眼表疾病，如反復(fù)性角膜上皮糜爛、角膜軟化癥等雖然角膜緣干細(xì)胞沒有受到損傷，但由于角膜上皮基底膜或者前彈力層壞死崩潰，角膜緣干細(xì)胞增殖移形形成的新的角膜上皮與前彈力層不能緊密結(jié)合也會(huì)最終致盲。而角膜移植是目前角膜上皮致盲疾病治愈的唯一途徑，但由于捐獻(xiàn)的供體角膜數(shù)量嚴(yán)重不足，致使絕大多數(shù)角膜上皮致盲患者無(wú)法通過角膜移植而重見光明。近年來(lái)興起的角膜組織工程，使組織工程角膜上皮的體外構(gòu)建成為可能，也為帶來(lái)了眾多角膜上皮致盲患者重見光明帶來(lái)了新的希望。但如何在體外獲得可用于組織工程角膜上皮構(gòu)建的大量角膜上皮細(xì)胞，一直是該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)和主攻方向之一。研究表明，通過組織塊的體外培養(yǎng)獲得可持續(xù)分裂的細(xì)胞群體是一種安全的建立連續(xù)性細(xì)胞系的方法，所建立的連續(xù)性細(xì)胞系能夠較好的保持細(xì)胞原有的生物學(xué)特性。細(xì)胞自組織塊遷出與貼壁是組織塊培養(yǎng)法的關(guān)鍵，而通過添加促細(xì)胞遷出和貼壁物質(zhì)羧甲基殼寡糖和IV型膠原可有效促進(jìn)細(xì)胞的遷出與貼壁。目前，已有學(xué)者利用猿猴空泡(SV40)病毒和端粒酶轉(zhuǎn)染的方法建立了人角膜上皮細(xì)胞系，但是由于細(xì)胞攜帶腫瘤病毒基因或癌基因而具有潛在的致瘤性，而無(wú)法用于組織工程角膜上皮的構(gòu)建和臨床角膜移植手術(shù)。因此， 盡早建立起一種不經(jīng)過任何病毒或癌基因轉(zhuǎn)染的、可直接用于組織工程角膜上皮構(gòu)建的人角膜上皮細(xì)胞系，已成為全世界眼科專家和細(xì)胞生物學(xué)家的主攻目標(biāo)，也是眾多角膜上皮致盲患者通過組織工程角膜上皮移植復(fù)明的關(guān)鍵所在。目前已開展了利用人角膜內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)建人角膜內(nèi)皮細(xì)胞系的相關(guān)研究，但由于人角膜內(nèi)皮和人角膜上皮細(xì)胞存在的組織結(jié)構(gòu)上的差異，利用人角膜內(nèi)皮細(xì)胞系的培養(yǎng)液以及培養(yǎng)方法來(lái)建立人角膜上皮組織還是存在著成體細(xì)胞在體外難分裂增殖和貼壁的問題。 此外，也有利用角膜緣組織進(jìn)行人角膜上皮細(xì)胞系的構(gòu)建研究，但目前為止，未見有利用人角膜上皮組織進(jìn)行人角膜上皮細(xì)胞系構(gòu)建的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種人角膜上皮細(xì)胞系的構(gòu)建方法，從而有效的建立起人角膜上皮細(xì)胞系，為組織工程角膜上皮構(gòu)建及組織工程全角膜構(gòu)建提供上皮細(xì)胞，以彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的補(bǔ)足。本發(fā)明的構(gòu)建方法如下先將角膜取出后用含抗生素的消毒液消毒，再將角膜進(jìn)行消化處理后，取下帶有前彈力層的角膜上皮，剪成小的角膜上皮組織塊后，將角膜上皮組織塊向下貼于培養(yǎng)孔的底部，使前彈力層向上；然后加入培養(yǎng)液在二氧化碳培養(yǎng)箱中、37°C下進(jìn)行貼板培養(yǎng)，培養(yǎng)期間換培養(yǎng)液，細(xì)胞長(zhǎng)成單層后用胰酶消化法進(jìn)行繼代培養(yǎng)，傳代至60代以上完成了人角膜上皮細(xì)胞系的構(gòu)建；其中，培養(yǎng)液為含有20%胎牛血清、0. 02%。 0. 04%。的人表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、0. 01%。 0. 02%。的人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、0. 4%。 1. 0%。羧甲基殼寡糖和 0. 25%。 1%。硫酸軟骨素的DMEM/F12培養(yǎng)液。培養(yǎng)液中所添加的羧甲基殼寡糖與羧甲基殼多糖相比，其分子質(zhì)量更小，水溶性更好，更易于細(xì)胞貼壁和生長(zhǎng)，在0. 4%。 1. 0%。的濃度范圍內(nèi)促細(xì)胞貼壁和生長(zhǎng)的效果最佳。為了更好的提高細(xì)胞的貼壁與遷出效果，上述的培養(yǎng)液中還添加有質(zhì)量比為 0. 08%。 0. 1%。的IV型膠原。所述的消毒液為用0. 9%生理鹽水配制的質(zhì)量比為20% 70%的慶大霉素溶液。上述方法中胰蛋白酶溶液的濃度為0. 2 0. 5%，最適消化時(shí)間為1 2分鐘，消化不到1分鐘則消化作用太弱，組織不夠疏松不利于細(xì)胞遷出；消化長(zhǎng)于2分鐘則消化過度會(huì)使細(xì)胞損失甚至死亡。本發(fā)明方法原代培養(yǎng)啟動(dòng)時(shí)將帶有前彈力層的角膜上皮撕下，以保證所獲得的細(xì)胞不摻雜其它細(xì)胞而為純凈的人角膜上皮細(xì)胞。上述的貼壁培養(yǎng)是先將貼有人角膜上皮組織塊的培養(yǎng)孔中加入0. 1 0. 3mL的專用培養(yǎng)液以保證組織塊獲得足夠的營(yíng)養(yǎng)又不至于培養(yǎng)液過多使組織塊不能貼壁，在二氧化碳培養(yǎng)箱中37°C下進(jìn)行貼板培養(yǎng)12-M小時(shí)后，每空再補(bǔ)加培養(yǎng)液至lmL，這樣可使組織塊牢固貼于孔底有利于細(xì)胞的遷出于貼壁。培養(yǎng)期間每隔3 5天更換上述專用培養(yǎng)液1次。人角膜上皮細(xì)胞自原代培養(yǎng)啟動(dòng)第3天開始從組織塊遷出，細(xì)胞為上皮樣，生長(zhǎng)分裂旺盛，30天后長(zhǎng)成細(xì)胞單層，經(jīng)過連續(xù)的繼代培養(yǎng)后已傳至60代，完成了人角膜上皮細(xì)胞系的構(gòu)建，細(xì)胞形態(tài)仍為上皮樣，生長(zhǎng)分裂依然十分旺盛。本發(fā)明的構(gòu)建方法利用人角膜上皮組織成功建立了未經(jīng)任何轉(zhuǎn)染的人角膜上皮細(xì)胞系，建立的細(xì)胞系可以連續(xù)傳代，經(jīng)過這種方法所獲得的傳代細(xì)胞可傳60代以上，能提供出大量的人角膜上皮細(xì)胞；細(xì)胞系未經(jīng)任何轉(zhuǎn)染、沒有致瘤性，可直接應(yīng)用于組織工程角膜上皮的構(gòu)建和臨床應(yīng)用；降低了組織工程角膜上皮生產(chǎn)和臨床治療的成本。本發(fā)明的方法為進(jìn)一步進(jìn)行組織工程全角膜的重建及應(yīng)用奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明構(gòu)建方法的總體步驟如下
1、角膜片貼板培養(yǎng)的啟動(dòng)從眼庫(kù)中取出2個(gè)完整的人角膜，放入100毫升玻璃燒杯中，加入10 30毫升濃度為0. 9%的生理鹽水，清洗5 9分鐘；吸出生理鹽水后，加入 10 30毫升的濃度為20% 70%的慶大霉素，浸泡15 35分鐘，于超凈工作臺(tái)中進(jìn)行消毒，以下操作均在超凈工作臺(tái)中進(jìn)行，所有用品均是無(wú)菌的；用眼科鑷從慶大霉素液中取出角膜，將角膜的凹面朝上平放于玻璃培養(yǎng)皿中，玻璃培養(yǎng)皿中加入0. 2 0. 5%胰蛋白酶 5 10毫升消化1 2分鐘；去除胰蛋白酶液，用眼科鑷撕下帶前彈力層的角膜上皮，用眼科剪沿角膜中心點(diǎn)把帶有前彈力層的角膜上皮平均剪成8片，用眼科鑷將角膜上皮面朝下平貼入M孔培養(yǎng)板的孔底，向貼入角膜上皮片的培養(yǎng)孔中加入0. 1 0. 3毫升培養(yǎng)液，培養(yǎng)液的體積量即保證角膜上皮片能夠很好的貼附在培養(yǎng)孔底，又保證組織片不會(huì)干燥。將培養(yǎng)板放入5%二氧化碳培養(yǎng)箱中，37°C進(jìn)行培養(yǎng)；2、組織塊法進(jìn)行人角膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)角膜上皮片貼板培養(yǎng)12-M小時(shí)后，向每個(gè)培養(yǎng)孔中補(bǔ)加角膜上皮細(xì)胞專用培養(yǎng)液至1毫升，于5%二氧化碳培養(yǎng)箱中、37°C培養(yǎng)； 每間隔3 5天，更換人角膜上皮細(xì)胞專用培養(yǎng)液一次。3、人角膜上皮細(xì)胞專用培養(yǎng)液的配制取常規(guī)配制的DMEM/F12培養(yǎng)液3. 0毫升， 然后依次加入硫酸軟骨素1 4毫克、羧甲基殼寡糖0. 2 0. 6毫克和IV型膠原0. 08 0. 4毫克，完全溶解后用0. 22微米的微孔濾膜過濾除菌，加入0. 8毫升胎牛血清，又添加了 0. 01%。 0. 02%。的人表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子和0. 01%。 0. 02%。的堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子， 補(bǔ)加常規(guī)配制的DMEM/F12培養(yǎng)液至4. 0毫升，即為本發(fā)明的人角膜上皮細(xì)胞專用培養(yǎng)液。4、人角膜上皮細(xì)胞的繼代培養(yǎng)待人角膜上皮細(xì)胞長(zhǎng)成單層后，吸出培養(yǎng)孔中的培養(yǎng)液，向每個(gè)培養(yǎng)孔中加入0. 5毫升濃度為0. 25%的胰蛋白酶溶液，靜置消化1 2分鐘；吸去胰蛋白酶溶液，每培養(yǎng)孔中加入1毫升的上述專用培養(yǎng)液，用滴管吹打培養(yǎng)孔底 3 5分鐘制成人角膜上皮細(xì)胞懸液；從每培養(yǎng)孔中分別取出0. 5毫升角膜上皮細(xì)胞懸液， 分別加入到新的培養(yǎng)孔中，每個(gè)培養(yǎng)孔補(bǔ)加上述專用培養(yǎng)液0. 5毫升，使之最終體積至1毫升；待人角膜上皮細(xì)胞再次長(zhǎng)成單層后，仍以上述的相同方法進(jìn)行繼代培養(yǎng)。實(shí)施例1從眼庫(kù)中取出2個(gè)完整的人角膜，放入100毫升玻璃燒杯中，加入10毫升濃度為 0.9%的生理鹽水，清洗5分鐘；吸出生理鹽水后，加入10毫升的濃度為20%的慶大霉素， 浸泡35分鐘，于超凈工作臺(tái)中進(jìn)行消毒；以下操作均在超凈工作臺(tái)中進(jìn)行，所有用品均是無(wú)菌的；用眼科鑷從慶大霉素液中取出角膜，將角膜的凹面朝上平放于玻璃培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿中加入0. 2%胰蛋白酶5毫升消化2分鐘后，去除胰蛋白酶液，用眼科鑷撕下帶有前彈力層的角膜上皮，用眼科剪沿角膜中心點(diǎn)把帶有前彈力層的角膜上皮平均剪成8片，用眼科鑷將角膜上皮面朝下平貼入M孔培養(yǎng)板的孔底，每個(gè)培養(yǎng)孔補(bǔ)加含有20%胎牛血清的 DMEM/F12培養(yǎng)液0. 1毫升；將培養(yǎng)板放入5%二氧化碳培養(yǎng)箱中，37°C進(jìn)行培養(yǎng)。取常規(guī)配制的DMEM/F12培養(yǎng)液3. 0毫升，完全溶解后用0. 22微米的微孔濾膜過濾除菌，加入0. 8毫升胎牛血清，又加入0. 01%。 0. 02%。的人表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子和0. 01%。 0. 02%。的堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，補(bǔ)加常規(guī)配制的DMEM/F12培養(yǎng)液至4. 0毫升，即為人角膜上皮細(xì)胞專用培養(yǎng)液。貼板培養(yǎng)12小時(shí)后，向每個(gè)培養(yǎng)孔中補(bǔ)加上述專用培養(yǎng)液至1毫升，于5%二氧化碳培養(yǎng)箱中、37°C培養(yǎng)；每間隔3天，更換人角膜上皮細(xì)胞專用培養(yǎng)液一次。待人角膜上皮細(xì)胞長(zhǎng)成單層后，吸出培養(yǎng)孔中的培養(yǎng)液，向每個(gè)培養(yǎng)孔中加入0. 5毫升濃度為0. 25%的胰蛋白酶溶液，靜置消化1分鐘；吸去胰蛋白酶溶液，每培養(yǎng)孔中加入1毫升的上述專用培養(yǎng)液，用滴管吹打培養(yǎng)孔底3分鐘制成人角膜上皮細(xì)胞懸液；從每個(gè)培養(yǎng)孔中分別取出 0. 5毫升角膜上皮細(xì)胞懸液，分別加入到新的培養(yǎng)孔中，每培養(yǎng)孔補(bǔ)加上述專用培養(yǎng)液0. 5 毫升，使之最終體積至1毫升；待人角膜上皮細(xì)胞再次長(zhǎng)成單層后，仍以上述的相同方法進(jìn)行繼代培養(yǎng)。實(shí)施例2從眼庫(kù)中取出2個(gè)完整的人角膜，放入100毫升玻璃燒杯中，加入30毫升濃度為 0. 9%的生理鹽水，清洗9分鐘；吸出生理鹽水后，加入30毫升的濃度為70%的慶大霉素， 浸泡15分鐘，于超凈工作臺(tái)中進(jìn)行消毒；以下操作均均為無(wú)菌狀態(tài)；用眼科鑷從慶大霉素液中取出角膜，將角膜的凹面朝上平放于玻璃培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿中加入0.5%胰蛋白酶10 毫升消化1分鐘；去除胰蛋白酶液，用眼科鑷撕下前彈力層，用眼科剪沿角膜中心點(diǎn)把帶有前彈力層的角膜上皮平均剪成8片，用眼科鑷將角膜上皮面朝下平貼入M孔培養(yǎng)板的孔底，向貼入角膜上皮片的培養(yǎng)孔中加入0. 3毫升含有20%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液；將培養(yǎng)板放入5%二氧化碳培養(yǎng)箱中，37°C進(jìn)行培養(yǎng)。在上述人角膜上皮細(xì)胞專用培養(yǎng)液中， 又添加了羧甲基殼寡糖0. 2毫克和硫酸軟骨素1毫克。貼板培養(yǎng)M小時(shí)后，向每個(gè)培養(yǎng)孔中補(bǔ)加上述專用培養(yǎng)液至1毫升，于5%二氧化碳培養(yǎng)箱中、37°C培養(yǎng)；每間隔5天，更換人角膜上皮細(xì)胞專用培養(yǎng)液一次。待人角膜上皮細(xì)胞長(zhǎng)成單層后，吸出培養(yǎng)孔中的培養(yǎng)液，向每個(gè)培養(yǎng)孔中加入0. 5毫升濃度為0. 25%的胰蛋白酶溶液，靜置消化2分鐘；吸去胰蛋白酶溶液，每培養(yǎng)孔中加入1毫升的上述培養(yǎng)液，用滴管吹打培養(yǎng)孔底5分鐘制成人角膜上皮細(xì)胞懸液；從每培養(yǎng)孔中分別取出0. 5毫升角膜上皮細(xì)胞懸液，分別加入到新的培養(yǎng)孔中， 每培養(yǎng)孔補(bǔ)加上述培養(yǎng)液0. 5毫升，使之最終體積至1毫升；待人角膜上皮細(xì)胞再次長(zhǎng)成單層后，仍以上述的相同方法進(jìn)行繼代培養(yǎng)。實(shí)施例3從眼庫(kù)中取出2個(gè)完整的人角膜，放入100毫升玻璃燒杯中，加入20毫升濃度為
0.9%的生理鹽水，清洗7分鐘；吸出生理鹽水后，加入20毫升的濃度為50%的慶大霉素， 浸泡20分鐘，于超凈工作臺(tái)中進(jìn)行消毒；以下操作均為無(wú)菌狀態(tài)；用眼科鑷從慶大霉素液中取出角膜，將角膜的凹面朝上平放于玻璃培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿中加入0. 35%胰蛋白酶7. 5 毫升消化1. 5分鐘；去除胰蛋白酶液，用眼科鑷撕下前彈力層，用眼科剪沿角膜中心點(diǎn)把帶有前彈力層的角膜上皮平均剪成8片，用眼科鑷將角膜上皮面朝下平貼入M孔培養(yǎng)板的孔底；向貼入角膜上皮片的培養(yǎng)孔中加入0. 2毫升含有20%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液；將培養(yǎng)板放入5%二氧化碳培養(yǎng)箱中，37°C進(jìn)行培養(yǎng)。在上述人角膜上皮細(xì)胞專用培養(yǎng)液中， 又添加了 0. 1%。的IV型膠原，以提高人角膜上皮細(xì)胞的貼壁與遷出效果。貼板培養(yǎng)18小時(shí)后，向每個(gè)培養(yǎng)孔中補(bǔ)加上述專用培養(yǎng)液至1毫升，于5%二氧化碳培養(yǎng)箱中、37°C培養(yǎng)；每間隔4天，將更換人角膜上皮細(xì)胞專用培養(yǎng)液一次。待人角膜上皮細(xì)胞長(zhǎng)成單層后，吸出培養(yǎng)孔中的培養(yǎng)液，向每個(gè)培養(yǎng)孔中加入0. 5毫升濃度為0. 25%的胰蛋白酶溶液，靜置消化
1.5分鐘；吸去胰蛋白酶溶液，每培養(yǎng)孔中加入1毫升的上述培養(yǎng)液，用滴管吹打培養(yǎng)孔底 4分鐘制成人角膜上皮細(xì)胞懸液；從每培養(yǎng)孔中分別取出0. 5毫升角膜上皮細(xì)胞懸液，分別加入到新的培養(yǎng)孔中，每培養(yǎng)孔補(bǔ)加上述培養(yǎng)液0. 5毫升，使之最終體積至1毫升；待人角膜上皮細(xì)胞再次長(zhǎng)成單層后，仍以上述的相同方法進(jìn)行繼代培養(yǎng)。
目前實(shí)施例1建立的人角膜上皮細(xì)胞系已傳至180代。已利用該細(xì)胞系細(xì)胞進(jìn)行了人角膜上皮體外重建研究，并將重建的角膜上皮進(jìn)行了的動(dòng)物移植實(shí)驗(yàn)，將所重建的組織工程人角膜上皮移植到去除角膜緣干細(xì)胞及刮除角膜上皮層的新西蘭兔眼中，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，移植的人角膜上皮可使兔眼角膜恢復(fù)透明，并且移植的上皮能夠防御細(xì)菌的侵染實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明構(gòu)建的人角膜上皮細(xì)胞系能夠很好的在移植的動(dòng)物上起到修復(fù)作用， 具有廣闊的開發(fā)前景。
權(quán)利要求
1.一種人角膜上皮細(xì)胞系的構(gòu)建方法，其特征在于所述的構(gòu)建方法是先將角膜取出后用含抗生素的消毒液消毒，再將角膜進(jìn)行消化處理后，取下帶有前彈力層的角膜上皮，剪成小的角膜上皮組織塊后，將角膜上皮組織塊貼于培養(yǎng)孔的底部，使角膜上皮面向下；然后加入培養(yǎng)液在二氧化碳培養(yǎng)箱中、37°c下進(jìn)行貼板培養(yǎng)，培養(yǎng)期間換培養(yǎng)液，細(xì)胞長(zhǎng)成單層后用胰酶消化法進(jìn)行繼代培養(yǎng)，培養(yǎng)至第60代完成了人角膜上皮細(xì)胞系的構(gòu)建；其中，培養(yǎng)液為含有20%胎牛血清、0. 02%。 0. 04%。的人表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、0. 01%。 0. 02%。的人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、0. 4%。 1. 0%。羧甲基殼寡糖和0. 25%。 1%。硫酸軟骨素的DMEM/ F12培養(yǎng)液。
2.如權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于上述的培養(yǎng)液中還添加有0.08%。
0. 1%。的IV型膠原。
3.如權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于上述的含抗生素的消毒液為用0.9%生理鹽水配制的質(zhì)量比濃度為20% 70%的慶大霉素溶液。
4.如權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于上述的角膜進(jìn)行消化處理是用濃度為 0. 2 0. 5%的胰蛋白酶溶液消化，消化時(shí)間為1 anin。
5.如權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于上述的貼壁培養(yǎng)是先將貼有人角膜上皮組織塊的培養(yǎng)孔中加入0. 1 0. 3mL的上述培養(yǎng)液，在二氧化碳培養(yǎng)箱中37°C下進(jìn)行貼板培養(yǎng)12-24小時(shí)后，每個(gè)培養(yǎng)孔再補(bǔ)加培養(yǎng)液至lmL。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種人角膜上皮細(xì)胞系的構(gòu)建方法，構(gòu)建方法是先將角膜消毒，再將角膜消化后，取下帶有前彈力層的角膜上皮，剪成小的組織塊后，將組織塊向下平貼于培養(yǎng)孔的底部，然后加入培養(yǎng)液在二氧化碳培養(yǎng)箱中、37℃下進(jìn)行貼板培養(yǎng)，培養(yǎng)期間更換培養(yǎng)液，細(xì)胞長(zhǎng)成單層后進(jìn)行傳代培養(yǎng)，現(xiàn)已傳至60代以上完成了人角膜上皮細(xì)胞系的構(gòu)建；其中，培養(yǎng)液為含有20％胎牛血清、0.02‰～0.04‰的人表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、0.01‰～0.02‰的人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、0.4‰～1.0‰羧甲基殼寡糖和0.25‰～1‰硫酸軟骨素的DMEM/F12培養(yǎng)液，此外培養(yǎng)液還添加了0.08‰～0.1‰的IV型膠原。本發(fā)明的構(gòu)建方法利用人角膜上皮組織成功建立了未經(jīng)轉(zhuǎn)染的人角膜上皮細(xì)胞系，建立的細(xì)胞系可以連續(xù)傳代，能提供出大量的人角膜上皮細(xì)胞。
文檔編號(hào)C12N5/071GK102168064SQ20111003901
公開日2011年8月31日 申請(qǐng)日期2011年2月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年2月16日
發(fā)明者孫愛, 徐彬, 楊洪收, 樊廷俊, 趙君 申請(qǐng)人:中國(guó)海洋大學(xué)