一種均相酶解纖維素的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種在NaOH/尿素/纖維素均相體系下，聚乙二醇馬來酰亞胺修飾纖 維素酶均相酶解纖維素及其溫控分離的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 纖維素是全球再生量最大的生物質(zhì)資源，每年生物合成量超過500億噸。纖維素 高值化利用的關(guān)鍵在于如何使其高效降解成單糖，進(jìn)而可以轉(zhuǎn)化成用途廣泛的重要化學(xué)品 或燃料。因此從長遠(yuǎn)考慮，實(shí)現(xiàn)纖維素高效轉(zhuǎn)化成單糖是解決化石資源日益減少所帶來的 全球資源危機(jī)的有效途徑之一。
[0003] 目前纖維素降解方法包括物理法、化學(xué)法和生物法，其中生物法是指利用纖維素 酶對纖維素中0 -糖苷鍵進(jìn)行特異性水解，從而制得糖類化合物的一種有效方法，具有對 環(huán)境友好，能耗低，副產(chǎn)物少等優(yōu)點(diǎn)，被認(rèn)為是最具應(yīng)用前景的轉(zhuǎn)化途徑。但是，由于纖維 素是線性長鏈高分子聚合物，其分子中的羥基易和分子內(nèi)或相鄰分子上的含氧基團(tuán)形成強(qiáng) 氫鍵作用，使纖維素分子共同組成結(jié)晶結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)使纖維素顯示出剛性和高度水不溶性， 大大減弱了纖維素酶對纖維素的可及性，導(dǎo)致纖維素的轉(zhuǎn)化率低，酶解周期長，成本高。因 此，需要尋找對纖維素有高效溶解能力的溶劑，以瓦解纖維素的這種高度結(jié)晶結(jié)構(gòu)，有利于 纖維素酶與纖維素的有效接觸，促進(jìn)其酶解。目前，對纖維素具有良好溶解能力的溶劑有 N-甲基嗎啉-N-氧化物（NMM0)、氯化鋰/二甲基乙酰胺（LiCl/DMAc)體系、氨基甲酸酯體 系和離子液體等，這些溶劑在不同程度上存在著價(jià)格高、溶解條件苛刻、易揮發(fā)、回收困難、 所得溶液粘稠等問題，極大地限制了纖維素的應(yīng)用。2005年武漢大學(xué)的張俐娜老師開發(fā)了 新一類溶解纖維素的溶劑體系，NaOH/尿素、NaOH/硫脲、LiOH/尿素水溶液體系，其中NaOH/ 尿素體系以其廉價(jià)和高效的溶解性能成為大家關(guān)注的熱點(diǎn)。采用7wt%NaOH/12wt%尿素 水溶液預(yù)冷至-12°C，它能迅速溶解纖維素（重均分子量Mw為1. 2X105)得到透明的溶液 (5min內(nèi)完全溶解）。該纖維素溶液在0~5°C的范圍內(nèi)能夠長時(shí)間保持穩(wěn)定的溶液態(tài)（約 1周）。這種新溶劑體系采用了最經(jīng)濟(jì)、最普通的化工原料，且所用的化學(xué)原料容易回收， 可循環(huán)使用，因此該體系被認(rèn)定是新一代無污染的綠色纖維素新溶劑。在該體系下，溶劑 小分子更易與纖維素上的-0H基團(tuán)結(jié)合形成新的氫鍵網(wǎng)絡(luò)從而破壞纖維素原有的分子內(nèi) 和分子間氫鍵，使得纖維素在小分子溶劑的包合下，以鏈狀形式均勻分布于水中，得到透明 的纖維素溶液。若能在該體系下實(shí)現(xiàn)均相酶解，同時(shí)反應(yīng)后將纖維素酶分離出來，進(jìn)行循環(huán) 利用，那么富含還原糖的NaOH/尿素體系就可通過pH的調(diào)節(jié)以適應(yīng)后期發(fā)酵生產(chǎn)?？梢栽O(shè) 想，按照以上的研宄思路，一個(gè)高效綠色的纖維素利用體系將被建立。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是創(chuàng)制具有高效高穩(wěn)溫敏的纖維素酶，以實(shí)現(xiàn)在NaOH/尿素體系下 纖維素的均相酶解及纖維素酶的有效回收。
[0005] 本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的：將7wt%NaOH/12wt%尿素水溶液預(yù)冷 至-12°C，然后加入微晶纖維素，得到均相溶液，pH值為13. 98,纖維素占溶劑的重量比 5-10%。在30°C下加入修飾纖維素酶，加入量為每毫升溶劑0. 5_5mg，反應(yīng)1小時(shí)，纖維素 轉(zhuǎn)化成還原糖的轉(zhuǎn)化率在70-80%。反應(yīng)結(jié)束后，體系降溫到-10°C，修飾酶主動(dòng)從反應(yīng)體 系中析出，可直接回收利用。
[0006] 本發(fā)明采用的修飾纖維素酶是這樣得到的：在30-35°C下，在檸檬酸-磷酸氫二鈉 緩沖溶液（pH= 7.0)中，加入天然纖維素酶，待其完全溶解后，緩慢加入等質(zhì)量的分子量 20000聚乙二醇馬來酰亞胺，混合均勻后，恒溫反應(yīng)3小時(shí)，停止反應(yīng)，通過透析純化得到修 飾纖維素酶，標(biāo)記為Cell-Mal20k。
[0007] 本發(fā)明采用的纖維素酶，酶活力：180〇11/毫克，最佳口11:4.8，最佳溫度50°〇。
[0008] 本發(fā)明采用微晶纖維素原料的分子量2. 5~5萬，聚合度153~300,灰分 < 0? 6%，粒徑 25 ~190ym。
[0009] 發(fā)明效果
[0010] 本發(fā)明提供的新型修飾纖維素酶，能在強(qiáng)堿性NaOH/尿素體系下表現(xiàn)出良好的活 性和穩(wěn)定性及溫敏性，很好地促進(jìn)纖維素降解，并可高效回收纖維素酶。使用本發(fā)明的方法 可提高天然纖維素酶抵制環(huán)境引起酶失活的能力，從而提高了酶的催化活性，在反應(yīng)過程 中始終保持較高的催化活性，并可實(shí)現(xiàn)酶的高效回收和重復(fù)使用，具有明顯的先進(jìn)性，將為 纖維素資源的綜合利用提供一條新的途徑。
【具體實(shí)施方式】
[0011] 以下結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步說明，并非限制本發(fā)明所涉及的范圍。
[0012] 實(shí)施例1 :
[0013] 微晶纖維素原料：分子量2. 5~5萬，聚合度153~300,灰分< 0. 6%，粒徑25~ 190um〇
[0014] 還原糖量的測定方法
[0015] DNS試劑：1. 6gDNS和21gNaOH，加入到200mL水中溶解，185g酒石酸鉀鈉溶于 500mL水中，與上溶液混合加入5g結(jié)晶酚，5g無水亞硫酸鈉攪拌溶解，冷卻定容于1000mL 容量瓶，儲(chǔ)于棕色瓶中7-10天后使用。
[0016] 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線：將葡萄糖在105°C下烘干2h至恒重，精確稱取0.lg用蒸餾水 溶解，并定容到l〇〇mL此濃度為1. 0mg/mL。取10支20mL的具塞刻度試管，依次加入OmL、 0. 2mL、0. 4mL、0. 6mL、0. 8mL、1.OmL、1. 2mL、1. 4mL、1. 6mL、1. 8mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后每支 試管中加入蒸餾水，總體積為2.OmL，再分別加入0. 5mLDNS試劑，搖均后在沸水中準(zhǔn)確放 置5min，取出用流水迅速冷卻，用蒸餾水定容至20mL，充分搖均后靜置20min。最后在波長 540nm處測各比色管中溶液的吸光值A(chǔ)，以吸光值作縱坐標(biāo)，相應(yīng)葡萄糖濃度C(mg/mL)作橫 坐標(biāo)，得到葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0017] 在裝有溫度計(jì)、冷凝管和轉(zhuǎn)子的50mL三口瓶中加入15mLpH= 7. 00. 1M的現(xiàn)配檸 檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液；設(shè)定水浴加熱溫度為35°C，待瓶內(nèi)溫度穩(wěn)定后加入150mg纖 維素酶粉末，緩慢攪拌溶解；稱取150mg分子量20000的單甲氧基聚乙二醇馬來酰亞胺作為 修飾劑，并開始計(jì)時(shí)，混合均勾；反應(yīng)3h后，反應(yīng)液通過透析袋（截留20k大分子）在pH= 4. 80. 1M的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液中透析過夜；得到純化修飾纖維素酶液，凍干得到修 飾纖維素酶粉。記作Cell-Mal20k，4°C下保存。
[0018] 稱取7. 5g7wt%NaOH/12wt%尿素水溶液于100mL三口瓶中，降溫到-12°C，加入 375mg微晶纖維素（5 %w/w)溶解5分鐘，得到均相溶液，體系pH值13. 98。在此均相溶液 中加入15.Omg的Cell-Mal20k，30°C下反應(yīng)1小時(shí)后，取0. 5mL反應(yīng)酶液，加入1. 5mLDNS 試劑，沸水終止反應(yīng)顯色5min，冰水冷卻至室溫，蒸餾水定容至20mL。在540nm下測定吸光 度值，代入標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖曲線，得到還原糖量達(dá)到4. 25mg/mL，纖維素轉(zhuǎn)化為還原糖的轉(zhuǎn)化率 為70%。反應(yīng)結(jié)束后，體系降溫到-10°C，修飾酶自動(dòng)從體系中析出，經(jīng)離心后回收，無需任 何處理，直接回用。
[0019] 實(shí)施例2 :
[0020]微晶纖維素原料：分子量2. 5~5萬，聚合度153~300,灰分< 0. 6%，粒徑25~ 190um〇
[0021] 還原糖量的測定方法和修飾酶的制備方法：參見實(shí)施例1。
[0022] 稱取7. 5g7wt%NaOH/12wt%尿素水溶液于100mL三口瓶中，降溫到-12°C，加入 450mg微晶纖維素（6 %w/w)溶解5分鐘，得到均相溶液，體系pH值13. 98。在此均相溶液 中加入15.Omg的Cell-Mal20k，30°C下反應(yīng)1小時(shí)后，取0. 5mL反應(yīng)酶液，加入1. 5mLDNS 試劑，沸水終止反應(yīng)顯色5min，冰水冷卻至室溫，蒸餾水定容至20mL。在540nm下測定吸光 度值，代入標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖曲線，得到還原糖量達(dá)到4. 37mg/mL，纖維素轉(zhuǎn)化為還原糖的轉(zhuǎn)化率 為72%。反應(yīng)結(jié)束后，體系降溫到-10°C，修飾酶自動(dòng)從體系中析出，經(jīng)離心后回收，無需任 何處理，直接回用。
[0023] 實(shí)施例3 :
[0024]微晶纖維素原料：分子量2. 5~5萬，聚合度153~300,灰分< 0. 6%，粒徑25~ 190um〇
[0025] 還原糖量的測定方法和修飾酶的制備方法：參見實(shí)施例1。
[0026] 稱取7. 5g7wt%NaOH/12wt%尿素水溶液于100mL三口瓶中，降溫到-12°C，加入 600mg微晶纖維素（8 %w/w)溶解5分鐘，得到均相溶液，體系pH值13. 98。在此均相溶液 中加入35.Omg的Cell-Mal20k，30°C下反應(yīng)1小時(shí)后，取0. 5mL反應(yīng)酶液，加入1. 5mLDNS 試劑，沸水終止反應(yīng)顯色5min，冰水冷卻至室溫，蒸餾水定容至20mL。在540nm下測定吸光 度值，代入標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖曲線，得到還原糖量達(dá)到4. 55mg/mL，纖維素轉(zhuǎn)化為還原糖的轉(zhuǎn)化率 為75%。反應(yīng)結(jié)束后，體系降溫到-10°C，修飾酶自動(dòng)從體系中析出，經(jīng)離心后回收，無需任 何處理，直接回用。
[0027] 實(shí)施例4 :
[0028] 微晶纖維素原料：分子量2. 5~5萬，聚合度153~300,灰分< 0. 6%，粒徑
[0029] 25 ~190ym。
[0030] 還原糖量的測定方法和修飾酶的制備方法：參見實(shí)施例1。
[0031] 稱取7. 5g7wt%NaOH/12wt%尿素水溶液于100mL三口瓶中，降溫到-12°C，加入 600mg微晶纖維素（8 %w/w)溶解5分鐘，得到均相溶液，體系pH值13. 98。在此均相溶液 中加入40.Omg的Cell-Mal20k，30°C下反應(yīng)1小時(shí)后，取0. 5mL反應(yīng)酶液，加入1. 5mLDNS 試劑，沸水終止反應(yīng)顯色5min，冰水冷卻至室溫，蒸餾水定容至20mL。在540nm下測定吸光 度值，代入標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖曲線，得到還原糖量達(dá)到4. 85mg/mL，纖維素轉(zhuǎn)化為還原糖的轉(zhuǎn)化率 為80%。反應(yīng)結(jié)束后，體系降溫到-10°C，修飾酶自動(dòng)從體系中析出，經(jīng)離心后回收，無需任 何處理，直接回用。
[0032] 實(shí)施例 5-11:
[0033] 實(shí)驗(yàn)條件與步驟同實(shí)施例1，只是將修飾酶改為實(shí)施例1中回收的修飾酶，進(jìn)行六 次重復(fù)回用實(shí)驗(yàn)，回用結(jié)果見表1。
[0034] 表1修飾酶的重復(fù)回用結(jié)果
[0035]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種均相酶解纖維素的方法，其特征在于以分子量為20000單甲氧基聚乙二醇馬 來酰亞胺為修飾劑，定點(diǎn)修飾市售纖維素酶的巰基，制得修飾纖維素酶，標(biāo)記為Cell-Mal 20k ;用合成的修飾酶Cell-Mal 20k在氫氧化鈉/尿素水溶液中均相酶解纖維素，反應(yīng)溫度 30°C，反應(yīng)時(shí)間lh，體系pH值13. 98,反應(yīng)結(jié)束后，冷卻至-10°C，Cell-Mal 20k與產(chǎn)物相 分層，分別回收Cell-Mal 20k和產(chǎn)物相，Cell-Mal 20k無需處理，可直接循環(huán)使用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種均相酶解纖維素的方法，以分子量為20000單甲氧基聚乙二醇馬來酰亞胺為修飾劑，定點(diǎn)修飾市售纖維素酶的巰基，制得修飾纖維素酶，標(biāo)記為Cell-Mal 20k；用合成的修飾酶Cell-Mal 20k在氫氧化鈉/尿素水溶液中均相酶解纖維素，反應(yīng)溫度30℃，反應(yīng)時(shí)間1h,體系pH值13.98，反應(yīng)結(jié)束后，冷卻至-10℃，Cell-Mal 20k與產(chǎn)物相分層，分別回收Cell-Mal 20k和產(chǎn)物相，Cell-Mal 20k無需處理，可直接循環(huán)使用。本發(fā)明的特點(diǎn)在于所制備的修飾纖維素酶穩(wěn)定性高且具有溫敏性，在強(qiáng)堿性的氫氧化鈉/尿素水溶液中仍能保持高的活性和溫控性，實(shí)現(xiàn)了酶的高效回收和重復(fù)使用，為纖維素提供了一條高效酶解的新途徑。
【IPC分類】C12N9-96, C12P19-14, C12P19-02, C12N9-42
【公開號】CN104830926
【申請?zhí)枴緾N201410817928
【發(fā)明人】李露, 于世濤, 劉仕偉, 劉福勝, 解從霞
【申請人】青島科技大學(xué)
【公開日】2015年8月12日
【申請日】2014年12月25日