壤霉菌(Agromyces sp.)MT-E在降解多種鄰苯二甲酸酯中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及環(huán)境污染物生物處理技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及壤霉菌) MT-E在降解多種鄰苯二甲酸酯中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 鄰苯二甲酸酯，又稱酞酸酯，縮寫(xiě)PAEs，是鄰苯二甲酸形成的酯的統(tǒng)稱。其中，鄰 苯二甲酸二丁醋（di_/?-butylphthalate，DBP)和鄰苯二甲酸二異辛醋（di_ (2-ethylhexyl) phthalate，DEHP)是兩種最廣泛使用的塑料增塑劑，在PVC塑料中其含量可達(dá)40~60%。近 幾十年來(lái)，我國(guó)塑料大棚和農(nóng)膜使用量急劇增加。隨著塑料薄膜的大量使用，越來(lái)越多的 DBP和DEHP被釋放進(jìn)入農(nóng)田土壤，它們已成為在農(nóng)田土壤中最常被檢出的有機(jī)污染物，檢 測(cè)級(jí)別達(dá)到mg/kg。研宄表明，這兩種鄰苯二甲酸酯具有高毒性，致畸性、致癌性和致突變 性，以及生殖毒性，已被美國(guó)環(huán)境保護(hù)局（EPA)列為優(yōu)先控制污染物。因此，我國(guó)農(nóng)業(yè)土壤 中的DBP和DEHP污染問(wèn)題亟待解決。
[0003] 由于這兩種鄰苯二甲酸酯的化學(xué)穩(wěn)定性很好，自然條件下通過(guò)光解、水解等化學(xué) 作用消失的速率非常緩慢，其半衰期長(zhǎng)達(dá)20年之久，絕大部分的DBP和DEHP主要是通過(guò) 生物降解途徑從環(huán)境中消失。其中微生物降解具有成本低，條件溫和，不產(chǎn)生二次污染等優(yōu) 點(diǎn)，符合構(gòu)建環(huán)境友好型及資源節(jié)約型社會(huì)的要求與發(fā)展趨勢(shì)。因此，利用微生物的降解作 用將DBP和DEHP轉(zhuǎn)化為無(wú)害物質(zhì)是去除環(huán)境中鄰苯二甲酸酯污染的最佳手段。
[0004]目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者已分別針對(duì)DBP和DEHP篩選出許多具有良好降解性能的菌株， 但其中能夠同時(shí)降解這兩種鄰苯二甲酸醋的菌株很少。壤霉菌)是土壤中 廣泛存在的一類菌屬，目前有報(bào)道該菌屬的某些菌種具有可高效降解苯酚、農(nóng)藥噻蟲(chóng)嗪及 耐重金屬的特性，但尚未見(jiàn)其可降解鄰苯二甲酸酯的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明為了克服現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一株壤霉菌菌株的應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種降解鄰苯二甲酸二丁酯和/或鄰苯二甲酸二異 辛酯的菌懸液。
[0007] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明是通過(guò)以下方案予以實(shí)現(xiàn)的： 壤霉菌)MT-E在降解鄰苯二甲酸二丁醋和鄰苯二甲酸二異辛醋中的應(yīng) 用； 所述菌株于2015年1月22日保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC)，保藏編號(hào)為 CCTCC M 2015054。
[0008] 發(fā)明人從常年使用塑料大棚的農(nóng)田土壤中首次分離篩選獲得一株壤霉菌 )菌株MT-E，該菌株可同時(shí)降解鄰苯二甲酸二丁醋和鄰苯二甲酸二異辛醋； 因此，本發(fā)明要求保護(hù)該菌株在同時(shí)降解鄰苯二甲酸二丁酯和鄰苯二甲酸二異辛酯中的應(yīng) 用。
[0009] 壤霉菌)MT_E在降解鄰苯二甲酸二丁醋或鄰苯二甲酸二異辛醋中 的應(yīng)用； 所述菌株于2015年1月22日保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC)，保藏編號(hào)為 CCTCC M 2015054。
[0010] 因?yàn)槿烂咕?菌株MT-E即可以降解鄰苯二甲酸二丁酯，又能降解 鄰苯二甲酸二異辛酯；而鄰苯二甲酸二丁酯和鄰苯二甲酸二異辛酯是兩種最廣泛存在的塑 料污染物，因此本發(fā)明要求保護(hù)該菌株在降解鄰苯二甲酸二丁酯或鄰苯二甲酸二異辛酯中 的應(yīng)用。
[0011] 壤霉菌)MT_E在鄰苯二甲酸二丁醋和鄰苯二甲酸二異辛醋污染介 質(zhì)修復(fù)中的應(yīng)用； 所述菌株于2015年1月22日保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC)，保藏編號(hào)為 CCTCC M 2015054。
[0012] 優(yōu)選地，所述介質(zhì)為土壤、水或空氣。
[0013] 在保護(hù)以上菌株的應(yīng)用時(shí)，優(yōu)選的實(shí)施方式是將菌株MT-E制備成菌懸液用于降 解鄰苯二甲酸二丁酯和/或鄰苯二甲酸二異辛酯。
[0014] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果： 本發(fā)明從常年使用塑料大棚的農(nóng)田土壤中首次分離篩選獲得一株壤霉菌 )菌株MT-E，該菌株可同時(shí)降解鄰苯二甲酸二丁醋和鄰苯二甲酸二異辛醋； 豐富了鄰苯二甲酸酯降解菌的種質(zhì)資源庫(kù)，而且該菌株在土壤中分布廣泛，易于培養(yǎng)，適應(yīng) 能力強(qiáng)；另外通過(guò)土壤修復(fù)實(shí)驗(yàn)說(shuō)明了該菌實(shí)際污染土壤的生物處理中將有巨大的應(yīng)用前 景。
【附圖說(shuō)明】
[0015] 圖1為MT-E菌株在LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)7天的生長(zhǎng)形態(tài)特征。
[0016] 圖2為MT-E菌株的掃描電鏡照片。
[0017] 圖3為MT-E菌株的16S rDNA的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。
[0018] 圖4為MT-E菌株對(duì)DBP和DEHP的降解動(dòng)力學(xué)及生長(zhǎng)曲線。
[0019] 圖5為MT-E菌株對(duì)污染土壤中DBP和DEHP的降解效果。
【具體實(shí)施方式】
[0020] 下面結(jié)合說(shuō)明書(shū)附圖和具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步詳細(xì)闡述本發(fā)明。本發(fā)明以下實(shí)施例 為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，本發(fā)明主要闡述所述菌株以及基于所述菌株的應(yīng)用思想，實(shí)施 方式中簡(jiǎn)單參數(shù)的替換不能一一在實(shí)施例中贅述，但并不因此限制本發(fā)明的保護(hù)范圍，其 他任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，應(yīng)被視為等 效的置換方式，包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0021] 實(shí)施例中所述培養(yǎng)基配方如下： 無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)液（MSM，g/L) :K2HP04:5. 8, KH2P04:4. 5,（NH4)2S04:2. 0，MgCl 2:0. 16, CaCl 2: 0? 02, Na2Mo04 ? 2H20 :0? 0024, FeCl3:0. 0018, MnCl 2 ? 2H20 :0? 0015。最終 pH 為 7. 5。
[0022] 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（LB):酵母粉5. 0 g，蛋白胨10. 0 g，氯化鈉10. 0 g，加超純 水至1L，調(diào)節(jié)pH= 7. 0 ;121°C滅菌20min。固體平板則添加1. 5% (w/v)瓊脂粉。
[0023] 實(shí)施例1菌株的分離與鑒定 采集常年使用塑料大棚的農(nóng)田土壤，稱取5 g新鮮土壤樣品于含有50 mL無(wú)菌水的150 mL三角瓶中，在30°C，150 rpm培養(yǎng)3天后取5 mL污泥懸液加入含有100 mL DBP和DEHP (分別為50 mg/L)的MSM培養(yǎng)基中。經(jīng)30°C，150 rpm培養(yǎng)7天后，每次按1 mL的接種量 連續(xù)富集、轉(zhuǎn)接10次，并相應(yīng)提高培養(yǎng)基中PAEs含量至1000 mg/L。然后將馴化10次的培 養(yǎng)液稀釋1〇3~1〇5涂布于LB固體平板上，30°C倒置培養(yǎng)1~3天。待平板上長(zhǎng)出單菌落后， 挑取單菌落多次劃線純化，分離獲得一株細(xì)菌，編號(hào)MT-E。然后將菌株接種于LB固體平板 上30°C倒置培養(yǎng)7天，觀察其菌落形態(tài)(見(jiàn)圖1)。由圖1可知，菌落呈暗黃色、扁平、濕潤(rùn)、 邊緣不平整、擴(kuò)散生長(zhǎng)，七天后幾乎鋪滿平板。
[0024] 掃描電鏡觀察鑒定：將純化后的菌株MT-E接入含有10 mL的LB液體培養(yǎng)基過(guò)夜 活化。吸取800 yL菌液經(jīng)8000 rpm離心3~5 min，去上清液，加入500 yL PBS溶液洗 菌3次。在收獲的菌體沉淀中加入1 mL的2. 5%戊二醛充分混勻，4°C靜置過(guò)夜。然后再次 經(jīng)8000 rpm離心3~5 min，去上清液，加入500 y L PBS溶液洗菌3次。隨后將菌體分別在 30%，50%，70%，85%，90%和100%的梯度乙醇中脫水2次，每個(gè)梯度約浸泡15 min，然后8000 rpm離心去上清液，最后用乙酸異戊酯置換乙醇2次，每次20 min，方法同上述乙醇脫水過(guò) 程。經(jīng)過(guò)〇)2干燥后制片觀察。圖2可見(jiàn)在掃描電鏡下MT-E菌體呈短桿狀，長(zhǎng)約0.8~1.5 微米，寬約〇. 3~ 0. 5微米。
[0025] 將MT-E菌株進(jìn)行生理生化特征鑒定，鑒定結(jié)果見(jiàn)表1。
[0026] 表1. MT-E菌株的生理生化特征鑒定 注：" + "代表陽(yáng)性;"」"代表陰性 '
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 壤霉菌（)MT-E在同時(shí)降解鄰苯二甲酸二丁醋和鄰苯二甲酸二異辛醋 中的應(yīng)用；所述菌株于2015年1月22日保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC)，保藏編 號(hào)為CCTCCM2015054。
2. 壤霉菌（)MT-E在降解鄰苯二甲酸二丁醋或鄰苯二甲酸二異辛醋中的 應(yīng)用； 所述菌株于2015年1月22日保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC)，保藏編號(hào)為CCTCCM2015054。
3. 壤霉菌（)MT-E在修復(fù)鄰苯二甲酸二丁醋和/或鄰苯二甲酸二異辛醋 污染介質(zhì)中的應(yīng)用； 所述菌株于2015年1月22日保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC)，保藏編號(hào)為CCTCCM2015054。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述介質(zhì)為土壤、水或空氣。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的應(yīng)用，其特征在于，將菌株MT-E制備成菌懸液用于降 解鄰苯二甲酸二丁酯和/或鄰苯二甲酸二異辛酯。
【專利摘要】本發(fā)明屬于環(huán)境污染物生物處理技術(shù)領(lǐng)域，具體公開(kāi)了壤霉菌(Agromycessp.)MT-E在降解多種鄰苯二甲酸酯中的應(yīng)用，所述菌株于2015年1月22日保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC），保藏編號(hào)為CCTCC M 2015054。該菌能夠以DBP和DEHP為唯一碳源進(jìn)行好氧降解，在分別含有200mg/L的DBP和DEHP為唯一碳源的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中7天的降解率分別可達(dá)97.06%和86.25%。將該菌接種于污染土壤10天后，土壤中DBP和DEHP的降解率分別可達(dá)77.29%和55.51%，其高效的降解速率說(shuō)明該菌在PAEs污染的土壤修復(fù)中具有良好的應(yīng)用前景。CCTCC M 201505420150122
【IPC分類】C02F101-34, C12N1-14, C02F3-34, B09C1-10, C12R1-645, B01D53-84, B01D53-72
【公開(kāi)號(hào)】CN104845890
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510066068
【發(fā)明人】莫測(cè)輝, 趙海明, 李彥文, 蔡全英, 李慧, 杜歡, 向壘, 陳學(xué)斌
【申請(qǐng)人】暨南大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年8月19日
【申請(qǐng)日】2015年2月9日