一株具有殺線蟲活性的草酸青霉菌nbc008、其制備方法及應用
【專利摘要】本發(fā)明涉及一株具有殺線蟲活性的草酸青霉菌NBC008、其制備方法及應用。本發(fā)明從挪威東福爾郡小麥孢囊線蟲群體上分離篩選出一株活性較高的真菌菌株P.oxalicum NBC008，保藏編號CGMCC No.12473。通過液體發(fā)酵培養(yǎng)制備，其發(fā)酵產(chǎn)物對植物寄生線蟲有明顯的毒殺作用。室內測定本菌株發(fā)酵液對大豆孢囊線蟲2齡幼蟲和卵孵化的影響。不同稀釋濃度發(fā)酵液的處理對大豆孢囊線蟲2齡幼蟲具有毒殺作用，對卵孵化具有明顯的抑制作用。發(fā)酵原液能使大豆孢囊數(shù)量下降59.88％，具有良好的開發(fā)應用前景。CGMCC No.1247320160517
【專利說明】
一株具有殺線蟲活性的草酸青霉菌NBC008、其制備方法及 應用
技術領域
[0001] 本發(fā)明屬于微生物農藥技術領域，具體涉及一株具有毒殺植物寄生線蟲的真菌及 其制備方法和應用。
【背景技術】
[0002] 植物寄生線蟲是重要的植物病原物之一，在全世界普遍發(fā)生，其寄主范圍廣，為害 嚴重，全世界每年由植物寄生線蟲造成的經(jīng)濟損失高達1570億美元（簡恒，2011.植物線蟲 學.北京：中國農業(yè)大學出版社）。其中，大豆孢囊線蟲（Soybean Cyst Nematode，SCN)是為 害最為嚴重的植物寄生線蟲之一。
[0003] 大豆孢囊線蟲，在我國發(fā)現(xiàn)最早（1899年），最初學名采用Heterodera schachtii， 這是甜菜孢囊類線蟲的學名。1952年Ichinohe通過細致的觀察，單獨建立大豆孢囊線蟲 Heterodera glycines這個種(劉維志.2004.植物線蟲志·北京：中國農業(yè)大學出版社）。大 豆孢囊線蟲主要為害大豆根部，現(xiàn)在已在日本（Ichinohe M. 1988.Current research on the major nematode problems in Japan.Journal of Nematology.20(2):184-190·)、美 國（Wrather J.A.,Koenning S.R.,Anderson T.R.2003.Effect of diseases on soybean yields in the United States and 0ntario(1999to 2002).Plant Health Progress (March) .0-16·)、意大利（Manachini D.2000.First report of Heterodera glycines Ichinohe on soybean in Italy.Bolletino di Zoologia Agraria e Bachicoltura, Serie 11.32:261-267·)、巴西（Asmus G.L.，Teles T.S.，Anselmo J.et al.2012.Races of Heterodera glycines in the Northeast of Mato Grosso do Sul,Brazil.Tropical Plant Pathology.37(2) :146-148.)等15個國家和地區(qū)發(fā)現(xiàn)報道。在我國，主要分布在東北 和黃淮海等共16個省市自治區(qū)。大豆孢囊線蟲病的流行可造成大豆減產(chǎn)10%_20%，重者達 50%，甚至絕產(chǎn)（Liu X.，Li J.，Zhang D.1997.History and status of soybean cyst nematode in China.International Journal of Nematology·7(1):18-25·)〇
[0004] 目前防治大豆孢囊線蟲的防治仍以化學藥劑為主，但由于存在毒性高、污染環(huán)境， 對人畜健康存在潛在威脅等問題(張克勤，何世川，周薇等.1991.真菌和細菌在線充生防中 的作用及其研究進展.殺蟲微生物.3:55-66)，減少化學農藥的使用成為一種必然。因此尋 找一種環(huán)境友好的方法來防治線蟲十分必要。生物防治作為一種安全有效手段在植物病原 線蟲防治中得到了廣泛的研究和應用。淡紫擬青霉(Paecilomyces lilacinus)，它不僅能 夠寄生孢囊線蟲，還能夠抑制線蟲的活動(姜培增，李宏園，陳鐵保.2006.淡紫擬青霉防治 植物線蟲研究進展.中國農業(yè)科技導報，8(6) :38-14.)。洛斯里被毛孢霉（Hirsutella rhossiliensis)能使大豆孢囊線蟲種群數(shù)量降低79% (Zhang L.，Yang E·，Xiang M.et al.2008.Population dynamics and biocontrol efficacy of the nematophagous fungus Hirsutella rhossiliensisas affected by stage of the soybean cyst nematode .Biological Control,47(2): 244-249)。根內益生菌印度梨形抱（Piriform osporaindica)能夠降低大豆孢囊線蟲卵的密度（Bajaj R.，Hu W.，Huang Y.et al. 2015. The beneficial root endophyte Piriform osporaindica reduces egg density of the soybean cyst nematode .Biological Control ,90:193-199·)。鏡刀菌發(fā) 酵原液能夠抑制孢囊孵化并且有極強的殺線蟲活性，處理lh線蟲死亡率高達90% (趙曉暉， 許艷麗.2011.鐮刀菌發(fā)酵液對大豆孢囊線蟲的抑制作用.大豆科學，30(3): 468-470.)。然 而，被開發(fā)成防治線蟲的生防制劑很少。因此，本發(fā)明以大豆孢囊線蟲為靶標，從真菌代謝 產(chǎn)物中尋找具有高效殺線蟲活性物質，為研究開發(fā)新型生物殺線蟲劑尋找新的資源。

【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明的目的是選擇對孢囊線蟲具高殺線蟲活性的真菌菌株，將菌株按常規(guī)液體 發(fā)酵液培養(yǎng)后，除去菌體，從代謝產(chǎn)物中提取具有殺線蟲活性物質的有效成分，開發(fā)殺線蟲 生物農藥。
[0006] 本發(fā)明篩選到的一株具有殺線蟲活性的真菌菌株是Penicil lium oxali cum NBC008,保藏編號為CGMCC No.12473。
[0007] 一種真菌發(fā)酵液，其特征在于：上述真菌菌株經(jīng)液體發(fā)酵培養(yǎng)制成，其pH為4.1-4.4〇
[0008] 所述液體發(fā)酵所用的培養(yǎng)基為含氯霉素的馬鈴薯液體發(fā)酵培養(yǎng)基，其pH為5.4-5 · 8〇
[0009] 真菌發(fā)酵液的制備方法，此方法具體為:將直徑為lcm含上述真菌菌株的菌餅接種 到馬鈴薯液體發(fā)酵培養(yǎng)基內，26°C黑暗條件下150rpm/min培養(yǎng)120h，除去菌體后而得到。
[0010] 所述除去菌體采用4層滅菌紗過濾，濾液再經(jīng)0.22μπι細菌過濾器，收集濾過液體。
[0011] 上述真菌菌株在植物寄生線蟲生物防治中的應用。
[0012] 所述應用是將真菌菌株制備成真菌發(fā)酵液噴灑或澆灌感染植物寄生線蟲的作物。
[0013] 所述植物寄生線蟲為孢囊線蟲(Heterodera spp.)。
[0014] 本發(fā)明通過研究發(fā)現(xiàn)，從挪威東福爾郡小麥孢囊線蟲群體上分離的絕大多數(shù)菌株 都具有一定的殺線蟲活性，從這些菌株中篩選出一株活性較高的真菌菌株P.oxalicum NBC008進行了進一步的研究。
[0015] 本發(fā)明還涉及用于防治植物寄生線蟲的真菌發(fā)酵液，其是由本發(fā)明的真菌菌株 P. oxalicum NBC008經(jīng)過常規(guī)液體發(fā)酵培養(yǎng)后制備的。
[0016] 本發(fā)明的菌株P.oxalicum NBC008是通過平板培養(yǎng)來制備后，再經(jīng)擴大發(fā)酵培養(yǎng) 來制備。
[0017] 其具體方法如下：
[0018] 1.平板培養(yǎng)
[0019] 培養(yǎng)基為馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基(PDA)，購自青島海博生物技術有限公司，其配方為馬 鈴薯浸粉6.0g，葡萄糖20.0g，瓊脂20.0g，水1000ml，pH值5.4-5.8。
[0020] 2.液體發(fā)酵培養(yǎng)
[0021]其中液體培養(yǎng)基為馬鈴薯液體培養(yǎng)基(PDB)，購自青島海博生物技術有限公司，其 配方為：馬鈴薯浸出粉6.0g，葡萄糖20.0g，氯霉素0.1 g，水1000ml，pH為5.4-5.8。從培養(yǎng)皿 上取直徑為lcm的真菌菌餅接種到250ml錐形瓶（內裝PDB 100ml)中，26°C黑暗條件下 150rpm/min 振蕩培養(yǎng) 120h。
[0022]本發(fā)明所涉及的菌株P.oxalicum NBC008發(fā)酵液具有殺線蟲活性物質，可用于植 物寄生線蟲的防治，特別是孢囊線蟲。
[0023]生物保藏信息：
[0024] 草酸青霉NBC008，分類名為草酸青霉(penicillium oxalicum)
[0025] 保藏號：CGMCC No .12473。
[0026] 保藏日期:2016年5月17日
[0027]保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心
[0028] 保藏地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編 100101
【具體實施方式】
[0029] 為了更詳細地闡明而不是限制本發(fā)明，給出了下列實施例。
[0030] 本發(fā)明通過研究發(fā)現(xiàn)，從小麥孢囊線蟲群體上分離的P.oxalicum NBC008具有較 好的殺線蟲活性，PDA培養(yǎng)基26°C培養(yǎng)一周后，菌落呈橢圓形，長軸40-45mm，短軸30-35mm， 生長初期菌落表面呈粉色，后期變成綠色。顯微鏡下觀察，分生孢子梗長，柱狀，頂端生排列 成掃帚狀的間枝，分生孢子卵圓形，綠色。PDB發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵液呈酸性，pH在4.1-4.4之間。
[0031] 生物保藏信息：保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號 為CGMCC No.12473。
[0032] 本發(fā)明的菌株P.oxalicum NBC008是通過平板培養(yǎng)來制備后，再經(jīng)擴大發(fā)酵培養(yǎng) 來制備發(fā)酵液。
[0033] 實施例1:菌株P.oxalicum NBC008發(fā)酵液的制備
[0034] 將菌株P.oxalicum NBC008菌絲體接種到TOA平板上，26°C培養(yǎng)10天，用滅菌打孔 器從平板上取直徑為lcm的菌餅接種到250ml錐形瓶（內裝100ml PDB)，26°C黑暗條件下 150rpm/min，振蕩培養(yǎng)120h。用4層滅菌紗布除去菌絲體后過0.22μπι細菌過濾器除菌，得到 發(fā)酵原液。將發(fā)酵原液稀釋不同倍數(shù)進行殺線蟲藥效測定。
[0035] 實施例2:菌株P.oxalicum NBC008的殺線蟲活性
[0036]在發(fā)酵液原液的基礎上依次稀釋1 X，5X，10 X，對大豆孢囊線蟲2齡幼蟲進行測 定。
[0037] 1制備試驗用藥劑
[0038]按前述液體發(fā)酵方法制備的真菌菌株P.oxalicum NBC008發(fā)酵液，用不同稀釋倍 數(shù)的發(fā)酵液進行殺線蟲活性測定。
[0039] 2制備試驗用線蟲
[0040] 2.1大豆孢囊線蟲孢囊的收集
[0041]將從農科院廊坊中試基地采集的大豆孢囊線蟲危害的病土倒入一干凈塑料小桶 內，用強水流將病土沖散后，過20目/80目網(wǎng)篩，收集80目網(wǎng)篩上的沉積物，在解剖鏡下挑取 孢囊。
[0042] 2.2大豆孢囊線蟲2齡幼蟲的制備
[0043] 孢囊經(jīng)0.5%次氯酸鈉消毒3min，滅菌雙蒸水洗凈后，置于一干凈的100目網(wǎng)篩上， 將網(wǎng)篩置于一滅菌培養(yǎng)皿內，向皿內加3mmol/L氯化鋅至沒過孢囊，26°C黑暗條件下孵化。3 天后開始收集2齡幼蟲，并制成濃度為200頭/ml的2齡幼蟲懸浮液。
[0044] 2.3大豆孢囊線蟲卵懸浮液的制備
[0045] 孢囊經(jīng)0.5 %次氯酸鈉消毒3min，滅菌雙蒸水洗凈后，用軟木塞磨破孢囊，制成卵 懸浮液
[0046] 3.試驗方法
[0047] 3.1 菌株P.oxalicum NBC008的殺線蟲活性
[0048]向24孔板中加入不同稀釋倍數(shù)的發(fā)酵液0.5ml，稀釋同樣倍數(shù)的PDB作為對照，再 加入0.5ml 2齡幼蟲懸浮液，則最終稀釋濃度分別為2 X，10 X，20 X。室溫放置24h后統(tǒng)計線 蟲死亡數(shù)，并計算死亡率和校正死亡率。每個處理重復4次，該試驗重復2次。
[0049] 死亡率（％ )=死亡線蟲/供試線蟲X 100%
[0050] 校正死亡率（％) = (處理線蟲死亡率-對照線蟲死亡率)/(1-對照線蟲死亡率）X 100%
[0051 ] 3.2菌株P.oxalicum NBC008對大豆孢囊線蟲卵孵化的作用
[0052] 取不同濃度的發(fā)酵液100μ 1置于96孔板中，100μ 1滅菌水作為對照，再向其中加入 100μ1卵懸浮液(約50個），26 °C黑暗條件下孵化，12天后統(tǒng)計孵化的線蟲數(shù)，并計算孵化率。 每個處理重復4次。
[0053] 孵化率（％ )=孵化的卵個數(shù)/卵總個數(shù)X 100%
[0054] 孵化抑制率（％ )=(處理組孵化率-對照組孵化率)/對照組孵化率X 100%
[0055] 4試驗結果
[0056] (l)P.oxalicum NBC008代謝物對大豆孢囊線蟲2齡幼蟲的殺線蟲效果
[0057]結果表明，菌株P.oxalicum NBC008不同稀釋倍數(shù)發(fā)酵液都有較高的活性。其2X 稀釋液的校正死亡率能夠達到90%以上，10 X稀釋液在50%左右，具有$父尚的殺線蟲活性。
[0058] 表1草酸青霉發(fā)酵液不同稀釋倍數(shù)對小麥孢囊線蟲2齡幼蟲的影響
[0059]
[0060] 注：CK1 為稀釋 2 X PDB，CK2 為稀釋 10 X PDB，CK3 為稀釋 20 X PDB;
[0061]值為平均值土標準誤，字母為差異顯著性分析結果，下表同。
[0062] (2)P.oxalicum NBC008代謝物對大豆孢囊線蟲卵孵化的作用
[0063] 結果表明，經(jīng)不同濃度發(fā)酵液處理的卵孵化率均顯著低于對照組，說明NBC008發(fā) 酵液對大豆孢囊線蟲卵孵化均有抑制作用，且不同濃度的抑制作用差異不顯著。
[0064] 表2.草酸青霉NBC008不同濃度發(fā)酵液對大豆孢囊線蟲卵孵化的影響
[0065]
[0066]注:CK為滅菌水對照，字母為差異顯著性分析結果。
[0067] 實施例3:菌株P.oxalicum NBC008發(fā)酵液室內防治效果測定
[0068]利用發(fā)酵原液防治大豆孢囊線蟲和小麥孢囊線蟲，效果如下：
[0069] 1供試材料：
[0070] 大豆品種：中黃13
[0071] 線蟲:大豆孢囊線蟲
[0072] 2試驗方法：
[0073]菌株P.oxalicum NBC008發(fā)酵液室內防治大豆孢囊線蟲的效果測定 [0074]大豆種子表面用1 %次氯酸鈉消毒，滅菌水清洗三遍后，置于一次性培養(yǎng)皿中發(fā) 芽。2天后將發(fā)芽的種子種在裝有滅菌土的塑料杯中，每杯3顆種子。一周后，向塑料杯中加 入真菌發(fā)酵原液20ml，PDB作為對照。經(jīng)發(fā)酵原液處理24h后，在大豆根附近接種SCN二齡幼 蟲，300條/株，兩天后第二次接種SCN二齡幼蟲300條/株，接種30天后，統(tǒng)計每杯根系土壤中 的孢囊數(shù)量。
[0075] 3試驗結果
[0076] 結果表明：菌株P.oxalicum NBC008發(fā)酵原液處理后接種線蟲，形成的大豆孢囊數(shù) 量顯著低于對照組，孢囊減少率為59.88%，具有應用前景。
[0077] 表3.菌株P.oxalicum NBC008發(fā)酵原液防治大豆孢囊線蟲的效果測定
[0078]
[0079]注:CK為液體發(fā)酵用培養(yǎng)基TOB。
【主權項】
1. 一株具有殺線蟲活性的真菌菌株，命名為Penicillium oxalicum NBC008,保藏編號 為CGMCC No.12473。2. -種真菌發(fā)酵液，其特征在于：由權利要求1所述的真菌菌株經(jīng)液體發(fā)酵培養(yǎng)制成， 發(fā)酵液pH為4.1-4.4。3. 根據(jù)權利要求1所述的真菌發(fā)酵液，所述液體發(fā)酵所用的培養(yǎng)基為含氯霉素的馬鈴 薯液體發(fā)酵培養(yǎng)基，液體發(fā)酵培養(yǎng)基的pH為5.4-5.8。4. 權利要求2或3所述的真菌發(fā)酵液的制備方法，其特征在于:將直徑為lcm的含有權利 要求1所述真菌菌株的菌餅接種到馬鈴薯液體發(fā)酵培養(yǎng)基內，26°C黑暗條件下150rpm/min 培養(yǎng)120h，除去菌體后而得到。5. 根據(jù)權利要求4所述的制備方法，所述除去菌體采用4層滅菌紗過濾，濾液再經(jīng)0.22μ m細菌過濾器，收集濾過液體。6. 權利要求1所述的真菌菌株在植物寄生線蟲生物防治中的應用。7. 根據(jù)權利要求6所述的應用，是將權利要求1所述的真菌菌株制備成真菌發(fā)酵液噴灑 或澆灌感染植物寄生線蟲的作物。8. 根據(jù)權利要求6所述的應用，所述植物寄生線蟲為孢囊線蟲(Heterodera spp.)。
【文檔編號】C12N1/20GK106085911SQ201610486282
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月28日
【發(fā)明人】彭德良, 李婷, 黃文坤, 孔令安, 彭煥, 崔江寬
【申請人】中國農業(yè)科學院植物保護研究所