金鐵鎖懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系及其建立方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物細(xì)胞工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及金鐵鎖毛狀根高效誘導(dǎo)及基于此的 細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系的建立應(yīng)用方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 金鐵鎖（Psammosilene tunicoides W. C. Wu et C. Y. Wu)為石竹科金鐵鎖屬多年 生草本植物，又名獨(dú)丁子、小霸王、昆明沙參、金絲矮陀陀、土人參等，是我國西南部特有的 單屬種藥用植物。金鐵鎖主要以根入藥，主要藥用成分為三萜、三萜皂苷、環(huán)肽和內(nèi)酰胺等， 藥理研宄發(fā)現(xiàn)金鐵鎖提取物主要有鎮(zhèn)痛抗炎、散瘀止血、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抑菌等作用，用 于跌打損傷、風(fēng)濕痛、胃氣痛、創(chuàng)傷出血等的治療，是多種知名中成藥的主要成份之一，如云 南白藥系列、百寶丹系列、云南紅藥膠囊、貴州金骨蓮膠囊、福建痛血康膠囊等，具有很大的 經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會(huì)效益。
[0003] 近年來金鐵鎖的藥用需求量不斷增加，其野生資源連年過采、私采嚴(yán)重。由于森林 砍伐、植被石漠化、土層流失等原因，金鐵鎖生態(tài)環(huán)境也受到嚴(yán)重破壞。再加上自然氣候影 響及金鐵鎖本身自然繁殖力差等諸多因素，造成金鐵鎖野生資源數(shù)量急劇下降，已作為稀 有瀕危物種列入《中國植物紅皮書》中，屬國家二級(jí)保護(hù)植物。由于金鐵鎖藥材主要靠采收 野生資源，收獲周期較長，受病蟲害、氣候等外部因素影響大，造成供應(yīng)量不易控制等實(shí)際 問題。因此尋求新的替代品或新技術(shù)以滿足市場需求和解決物種保護(hù)問題迫在眉睫。
[0004] 綜合考慮，采用生物技術(shù)方法是解決這一問題最為有效的途徑。一方面可以緩解 植物資源的匱乏，保護(hù)珍貴的野生植物資源，避免掠奪性開發(fā)；另一方面通過規(guī)?；募?xì)胞 培養(yǎng)技術(shù)可以定向調(diào)節(jié)細(xì)胞的次生代謝產(chǎn)物，使植物細(xì)胞定向合成有效的物質(zhì)，以提高、調(diào) 控中藥材有效成分含量，提高它的藥用價(jià)值和療效，降低中藥材生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)成本。盡管如 此，通過細(xì)胞培養(yǎng)等手段實(shí)現(xiàn)商業(yè)化生產(chǎn)的植物種類有限，主要原因是遺傳和藥用成分生 物合成的穩(wěn)定性差以及單位時(shí)間內(nèi)生物量小等，因此，篩選優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)細(xì)胞株是解決上述瓶 頸問題的關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)。
[0005] 毛狀根是發(fā)根農(nóng)桿菌侵染植物細(xì)胞導(dǎo)致的特殊不定根，具有遺傳穩(wěn)定、激素自養(yǎng)、 生長速度快和次級(jí)代謝強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，毛狀根作為一種轉(zhuǎn)基因器官，一種新的藥用原料，日益受 到國內(nèi)外研宄者的關(guān)注。試驗(yàn)表明，利用毛狀根作為外植體誘導(dǎo)的愈傷組織，也保持毛狀根 生長速度快、遺傳穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)，與普通金鐵鎖愈傷組織相比，固體培養(yǎng)條件下較短時(shí)間內(nèi)能 夠獲得較大的細(xì)胞產(chǎn)量，同時(shí)皂苷含量也較高。但是在毛狀根制備與液體培養(yǎng)過程中存在 的突出問題：（1)毛狀根誘導(dǎo)率低，20%左右，這是由于植物細(xì)胞與發(fā)根農(nóng)桿菌互作過程中 固有的特性決定的；（2)液體培養(yǎng)過程中成團(tuán)性，使內(nèi)部組織缺氧和養(yǎng)分，逐漸衰老甚至死 亡，導(dǎo)致產(chǎn)量降低。另一方面，在以毛狀根為原料的金鐵鎖懸浮細(xì)胞制備與培養(yǎng)嘗試中，也 屢次失敗，分析其原因，可能與金鐵鎖固有的生長習(xí)性相關(guān)。因此，需要進(jìn)一步考察分析，以 尋找合適的金鐵鎖懸浮培養(yǎng)體系的建立、培養(yǎng)及應(yīng)用的方法。以解決金鐵鎖自然資源缺乏 和市場產(chǎn)品緊缺的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的之一在于提供一種金鐵鎖懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系的建立方法，所述建立 方法使用金鐵索毛狀根為外植體誘導(dǎo)愈傷組織并建立懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系。
[0007] 優(yōu)選的技術(shù)方案中，上述建立方法中，所述的愈傷組織經(jīng)10~12mmol/L草酸鈣水 溶液浸泡預(yù)處理后用于建立懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系。
[0008] 更為具體的技術(shù)方案，所述的金鐵鎖懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系的建立方法包括如下步 驟：
[0009] (1)以金鐵鎖毛狀根為外植體誘導(dǎo)愈傷組織；
[0010] (2)使用10~12mmol/L草酸鈣水溶液浸泡愈傷組織20~40min ;
[0011] (3)步驟⑵處理后的愈傷組織按照4~6% (g(FW)/ml)的接種量接種至懸 浮培養(yǎng)基中，25±1 °C、110±5r. mirT1搖床上暗培養(yǎng)；所述的懸浮培養(yǎng)基是mMS+1. 5mg/ L2, 4-D+O. 5mg/L 6-BA+O. 25mg/L NAA+0. lmg/L KT+30g 蔗糖 /L ;
[0012] 其中，mMS培養(yǎng)基是在MS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加KC1，使鉀離子濃度達(dá)到50mmol/L 而得。
[0013] 其中，所述的步驟（1)，以金鐵鎖毛狀根為外植體誘導(dǎo)愈傷組織，包括如下步驟：
[0014] (a)愈傷誘導(dǎo)：選取金鐵鎖毛狀根，剪切成小段接種于添加有1.0mg/L 2, 4-D+l. Omg/L 6-BA+2. Omg/L NAA+30g/L蔗糖的MS固體培養(yǎng)基上，置于25± 1°C的暗室培 養(yǎng)3~4周；
[0015] (b)繼代培養(yǎng)：將步驟（a)誘導(dǎo)出的愈傷組織與外植體分離，將分離出的愈傷組織 接種于添加有 〇.5mg/L 2,4-D+l.Omg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+0.2mg/L KT+30g/L 蔗糖的 MS 培養(yǎng)基上，于25 ±1°C條件下暗培養(yǎng)，繼代周期25 ± 2d ;
[0016] (c)經(jīng)過5次以上繼代培養(yǎng)，選取合適的愈傷組織作為建立懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系的 材料。
[0017] 上述本發(fā)明的金鐵鎖懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系的建立方法中述及使用金鐵鎖毛狀根為 外植體，具體的技術(shù)方案中，所述的金鐵鎖毛狀根通過下述方法制備：
[0018] (a)取金鐵鎖無菌苗葉片，去除葉緣周圍組織但保留葉柄，用滅菌的10~15_〇1/ L的CuCl 2水溶液浸泡外植體10~15min后，用無菌濾紙吸干外植體表面水分；
[0019] (b)發(fā)根農(nóng)桿菌ACCC10060菌液接種于YEB固體培養(yǎng)基中，25°C ± 1下暗培養(yǎng)2~ 3d獲得發(fā)根農(nóng)桿菌ACCC10060克隆菌體；挑取發(fā)根農(nóng)桿菌ACCC10060克隆菌體，接種于YEB 培養(yǎng)基中，25°C ± 1振蕩培養(yǎng)；取1體積份0D值為0. 6~0. 8的菌液置于100體積份YEB 液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)至0D值為0. 6時(shí)收集菌液，3500rpm下離心10分鐘收集菌體；
[0020] (C)所得菌體均勻混入至100體積份含100umol/L乙酰丁香酮的MS固體培養(yǎng)基， 并將金鐵鎖外植體浸染于上述培養(yǎng)基中10~15分鐘，取出清潔表面后，將所得的發(fā)根農(nóng)桿 菌浸染的外植體接入共培養(yǎng)基中，于26±1°C條件下暗培養(yǎng)24h ;
[0021] 所述的共培養(yǎng)基是含100umol/L乙酰丁香酮的MS固體培養(yǎng)基；
[0022] (d)步驟（c)的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入抑菌繼代培養(yǎng)基，3~6d繼代培養(yǎng)一次，直至將菌除 凈；
[0023] 所述的抑菌繼代培養(yǎng)基是含有500mg/L頭孢噻肟鈉的無激素1/2MS固體培養(yǎng)基；
[0024] 所述的抑菌繼代培養(yǎng)是：26±1°C條件下，靜置暗培養(yǎng)；
[0025] (e)步驟（d)的培養(yǎng)物接入無激素1/2MS液體基本培養(yǎng)基進(jìn)行暗黑懸浮振蕩培養(yǎng)， 振蕩搖床轉(zhuǎn)速為110~120r ? mirT1。
[0026] 本發(fā)明的目的之二在于提供一種金鐵鎖懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系，所述細(xì)胞培養(yǎng)體系通 過上文所述的金鐵鎖懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系的建立方法制備。
[0027] 作為優(yōu)選的具體技術(shù)方案，本發(fā)明進(jìn)一步提供一種金鐵鎖懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系，通 過下述方法制備：
[0028] ①取金鐵鎖無菌苗葉片，去除葉緣周圍組織但保留葉柄，用滅菌的10~15mmol/L 的CuCl 2水溶液浸泡外植體10~15min后，用無菌濾紙吸干外植體表面水分；
[0029] ②發(fā)根農(nóng)桿菌ACCC10060菌液接種于YEB固體培養(yǎng)基中，25°C±1下暗培養(yǎng)2~ 3d獲得發(fā)根農(nóng)桿菌ACCC10060克隆菌體；挑取發(fā)根農(nóng)桿菌ACCC10060克隆菌體，接種于YEB 培養(yǎng)基中，25°C±1振蕩培養(yǎng)；取1體積份OD值為0. 6~0. 8的菌液置于100體積份YEB 液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)至OD值為0. 6時(shí)收集菌液，3500rpm下離心10分鐘收集菌體；
[0030] ③所得菌體均勻混入至100體積份含100umol/L乙酰丁香酮的MS固體培養(yǎng)基，并 將金鐵鎖外植體浸染于上述培養(yǎng)基中10~15分鐘，取出清潔表面后，將所得的發(fā)根農(nóng)桿菌 浸染的外植體接入共培養(yǎng)基中，于26±1°C條件下暗培養(yǎng)24h;
[0031] 所述的共培養(yǎng)基是含100umol/L乙酰丁香酮的MS固體培養(yǎng)基；
[0032] ④上一步驟的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入抑菌繼代培養(yǎng)基，3~6d繼代培養(yǎng)一次，直至將菌除凈；
[0033] 所述的抑菌繼代培養(yǎng)基是含有500mg/L頭孢噻肟鈉的無激素1/2MS固體培養(yǎng)基；
[0034] 所述的抑菌繼代培養(yǎng)是：26±1°C條件下，靜置暗培養(yǎng)；
[0035] ⑤上一步驟的培養(yǎng)物接入無激素1/2MS液體基本培養(yǎng)基進(jìn)行暗黑懸浮振蕩培養(yǎng)， 振蕩搖床轉(zhuǎn)速為110~120r ?mirT1;培養(yǎng)3~5天產(chǎn)生發(fā)根，繼續(xù)培養(yǎng)至毛狀根穩(wěn)定生長；
[0036] ⑥愈傷誘導(dǎo)：選取上一步驟的金鐵鎖毛狀根，剪切成小段接種于添加有l(wèi).Omg/ L2,4-D+l.0mg/L 6-BA+2. 0mg/L NAA+30g/L 蔗糖的 MS 固體培養(yǎng)基上，置于 25±1°C 的暗室 培養(yǎng)3~4周；
[0037] ⑦繼代培養(yǎng)：將上一步驟誘導(dǎo)出的愈傷組織與外植體分離，將分離出的愈傷組織 接種于添加有〇.5mg/L 2,4-D+l.Omg/L 6