用于致病微生物高通量快速檢測的微流控芯片及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)療衛(wèi)生檢測技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種可以同時針對多種病原微生物進行高通量快速檢測分析的微流控芯片，并提供了該芯片制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]公共場所存在的病原微生物會造成各種疾病在人群中傳播和擴散。隨著我國城市化進程的不斷加快，人流密集的城市公共場為病原微生物的滋生提供了條件，很多傳染性疾病具有較強的隱蔽性，危害很大，對公民健康造成了嚴重威脅。因此，開發(fā)快速檢測致病微生物的新技術(shù)，對于保障我國公共衛(wèi)生安全具有重要的現(xiàn)實意義。對于我國公共衛(wèi)生監(jiān)測部門來說，能夠快速檢測出這些病原微生物，并向公眾提出流行性疾病的預(yù)警信息，是極為重要的一項工作內(nèi)容。但是，受限到傳統(tǒng)檢測技術(shù)的限制，目前尚缺乏對公共場所病原微生物的快速檢測方法，監(jiān)測結(jié)果缺乏時效性。尤其是在偏遠地區(qū)，此類快速檢測更是難以開展。
[0003]目前，針對致病微生物的主流檢測方法主要有:(I)培養(yǎng)鏡檢法，即通過樣本的采集并使用不同的選擇性培養(yǎng)基進行擴繁，再挑取培養(yǎng)基上的菌落進行顯微鏡下分析。但該方法需要研宄人員有極其豐富的經(jīng)驗，耗時較長，培養(yǎng)所需的時間往往從數(shù)天到數(shù)周，工作效率很低。(2)免疫分析法，即通過免疫高等動物，產(chǎn)生相應(yīng)的特異性抗體，再利用抗體和抗原的特異性識別反應(yīng)來捕獲待測物，但傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫法(ELISA)或免疫熒光法(IFA/DFA)的分析耗時較長，且受到抗體供應(yīng)的限制，對于大量尚無商業(yè)化抗體的微生物則無法檢測到。(3)分子生物學(xué)檢測法，包括實時定量PCR和DNA微陣列技術(shù)等，都是利用了特異性核酸探針，可以準確地鑒定目標微生物，且具有靈敏度高和快速方便的特點，也是目前常用的檢測手段，但往往依賴龐大昂貴的設(shè)備和專業(yè)的操作人員。因此，當(dāng)前在針對致病微生物的實際衛(wèi)生檢測工作中，存在的一個嚴重問題是:在現(xiàn)場采集樣品后，依據(jù)現(xiàn)有的分析技術(shù)均無法快速得出結(jié)果，往往需要送到省會城市的實驗室進行分析測試，不但需要耗時數(shù)天乃至數(shù)周，而且價格昂貴，不利于衛(wèi)生執(zhí)法工作的現(xiàn)場開展。因此亟需一種具有便攜、快速和低成本特性的檢測技術(shù)，能夠在現(xiàn)場得出結(jié)果。近年來世界衛(wèi)生組織(WHO)也開始提倡建立一種新的快速診斷概念:現(xiàn)場快速檢測(Point-of-care test, P0CT)，即便攜性強、成本低廉、樣本需求量低和操作簡單，目標是在現(xiàn)場快速得出診斷結(jié)論。POCT的實現(xiàn)則依賴于將傳統(tǒng)的免疫學(xué)和分子生物學(xué)等分析方法在新的技術(shù)平臺上加以改進和整合。
[0004]因此，未來的技術(shù)發(fā)展主要集中在檢測儀器的微型化、便攜性和高通量上。當(dāng)前的微生物檢測的發(fā)展趨勢是:(I)便攜性強，以滿足現(xiàn)場快速布置的需要；(2)檢測通量高，以滿足針對多種微生物并行分析的需要；(3)制造簡單且成本低，以滿足大范圍普及應(yīng)用的需要。
[0005]儀器設(shè)備的微型化集中體現(xiàn)在微流控芯片技術(shù)平臺，該技術(shù)在醫(yī)學(xué)、生物和環(huán)境檢測分析領(lǐng)域有著巨大的應(yīng)用潛力，以微流控芯片為基礎(chǔ)的微型生物分析儀和傳感器是未來公共衛(wèi)生快速檢測技術(shù)的一大發(fā)展趨勢。
[0006]微流控芯片技術(shù)，或稱微機電技術(shù)(MEMS)，興起于上世紀末期，該技術(shù)集成了生物學(xué)、化學(xué)、醫(yī)學(xué)、微機電和微加工技術(shù)，通過在聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、單晶硅和玻璃等材料上構(gòu)建精密尺寸的微管道、閥門和腔室，由于芯片內(nèi)部管道和腔室的尺寸通常在微米甚至納米尺度，因此反應(yīng)所需的樣本量和試劑消耗量都極低(比常規(guī)檢測方法降低數(shù)倍至數(shù)百倍)，適合于對稀少樣本的檢測。試劑和樣本的消耗量可比常規(guī)方法降低數(shù)十倍。此外，微小體系中的流體具有很多新的特性，例如芯片內(nèi)的化學(xué)反應(yīng)速率往往比常規(guī)反應(yīng)高一至兩個數(shù)量級，很多常規(guī)方法需要數(shù)小時的反應(yīng)，在芯片內(nèi)部僅需數(shù)分鐘或數(shù)秒鐘?？梢姡⒘骺匦酒且环N能將傳統(tǒng)檢驗分析技術(shù)微縮化的新型平臺，這些芯片的體積往往只有數(shù)平方厘米，重量約數(shù)十克，特別便于攜帶，適合于現(xiàn)場快速檢測分析、現(xiàn)場得出結(jié)果。
[0007]相比于常規(guī)技術(shù)，微流控芯片的優(yōu)勢主要有:
[0008](I)體積小。微型化的反應(yīng)單元所需的試劑和樣品消耗量很低，能夠極大地降低成本；同時，微小的芯片便于攜帶，有利于現(xiàn)場檢測的應(yīng)用；
[0009](2)成本低。芯片聚合物材料成本低廉，且應(yīng)用模板技術(shù)制造，適合大規(guī)模生產(chǎn)；
[0010](3)速度快。在微流控芯片中進行微升乃至納升級的生物化學(xué)反應(yīng)，傳質(zhì)和傳熱效率更高，分子碰撞的概率更大，反應(yīng)速度更快；
[0011](4)集成化和自動化程度高。通過微加工技術(shù)，可以方便地在芯片內(nèi)整合多個反應(yīng)單元，從而有利于實現(xiàn)高通量并行檢測；
[0012](5)兼容性好。易于與其它分析技術(shù)，如微電極、生物傳感器技術(shù)相整合。
[0013]可見，以微流控芯片技術(shù)為基礎(chǔ)的微型且快速高效的生物醫(yī)學(xué)檢測設(shè)備，不但可以替代昂貴的常規(guī)儀器，而且具有更高的檢測靈敏度，更有利于簡化繁瑣的操作步驟。以核酸作為檢測對象的環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增技術(shù)(LAMP)可以在恒溫條件下對目標DNA進行19-1Ow倍擴增。在微流控芯片內(nèi)部進行微小體系的LAMP擴增反應(yīng)，不但對樣品的需求量極低(通常為微升或納升)，而且往往可以在一個小時內(nèi)完成從樣品的采集到檢測結(jié)果的得出。如果將LAMP擴增技術(shù)與微流控芯片技術(shù)相融合，進而開發(fā)出一種新型微生物檢測分析系統(tǒng)，則具有速度快、消耗低和便攜性強的優(yōu)勢，可以滿足現(xiàn)場快速檢測的需要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0014]本發(fā)明的目的在于提供一種具有高通量、便攜低價和制造簡單的特點的用于對多種病原微生物(可針對大腸桿菌、金黃葡萄球菌、銅綠假單孢菌、肺炎克萊伯氏桿菌和克氏檸檬酸桿菌等)并行檢測的微流控芯片，并提供該芯片的制備方法。
[0015]本發(fā)明提供一種基于LAMP擴增原理的高通量微生物檢測芯片，以光學(xué)透明材料為基材，由樣品流動管道和半球形LAMP擴增反應(yīng)室組成。
[0016]上述微流控芯片含有五條樣品流動管道(寬度為200 μ m，深度為30 μ m，長度為2cm)，并匯聚于芯片的中心進樣孔；每條樣品流動管道均分別與一個半球形的微腔室(半徑為Imm)相連接。
[0017]本發(fā)明中微流控芯片的基材為光學(xué)透性良好且具有彈性的聚二甲基硅氧烷聚合物(PDMS) ο
[0018]本發(fā)明的樣品進液管道及LAMP擴增微室的個數(shù)可由實際情況確定，可根據(jù)實際需求增加或減少管道和擴增微室的數(shù)量。
[0019]本發(fā)明的半球形LAMP擴增微室可以極大減少氣泡的產(chǎn)生。此外，半球形LAMP擴增微室的制備方法非常簡單且成本低廉。
[0020]整個系統(tǒng)的硬件控制部分包括計算機、操作系統(tǒng)(數(shù)控界面和集成化微流控芯片)以及數(shù)據(jù)采集和數(shù)據(jù)分析部分(計算機)。
[0021]本發(fā)明提供上述微流控芯片的制備方法:
[0022](I)基片制備:利用Prianha溶液對單晶硅片進行清洗，用氮氣吹干后采用AZ-50XT系列正光刻膠經(jīng)旋涂機甩涂后，在恒溫加熱板上烘烤固化；
[0023](2)曝光和烘焙:將設(shè)計好的樣品通道層和閥門控制層掩膜板分別置于硅片表面，利用紫外曝光機進行曝光；