膽管癌診治分子標(biāo)志物及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地涉及人MARCO基因在膽管癌診斷、治療中的用 途。
【背景技術(shù)】
[0002] 膽管癌（cholangiocarcinoma, CCA)是起源于膽管上皮細(xì)胞的一種惡性腫瘤，居 肝膽惡性腫瘤的第2位，僅次于肝細(xì)胞癌，約占消化系統(tǒng)腫瘤的3%。膽管癌可發(fā)生在肝外 膽管的各個(gè)部位，其中以近段膽管（肝門部膽管）最多見，約占58%，中遠(yuǎn)段膽管分別占 13%和18%，發(fā)生在膽囊管者占4%，另有7%為彌漫發(fā)生。
[0003] 目前臨床上用于膽管癌確診的方法包括：1)實(shí)驗(yàn)室檢查：以血總膽紅素、直接 膽紅素、堿性磷酸酶和γ-谷胺酰轉(zhuǎn)移酶為檢測(cè)指標(biāo)；2)影像學(xué)檢查，又分為超聲顯像檢 查、經(jīng)皮肝穿刺膽道造影（PTC)、內(nèi)鏡逆行膽胰管造影（ERCP)、CT檢查、磁共振膽胰管成像 (MRCP)、核素顯影掃描、選擇性肝動(dòng)脈造影和門靜脈造影。但是上述方法不能應(yīng)用于膽管癌 早期的診斷，因?yàn)榕R床上CCA的早期癥狀并不明顯，而目前作為治療CCA最有效的方案-手 術(shù)治療的關(guān)鍵恰恰在于疾病的早期發(fā)現(xiàn)，因此為了更有效的提高CCA的治愈率，如何早期 診斷越來越引起學(xué)者們的重視。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種可用于膽管癌早期診斷的 分子標(biāo)志物。相比傳統(tǒng)的膽管癌的診斷方法，使用基因標(biāo)志物來診斷膽管癌的具有及時(shí)性、 特異性和靈敏性，從而使患者在癌癥早期就能知曉癌癥風(fēng)險(xiǎn)，針對(duì)風(fēng)險(xiǎn)高低，采取相應(yīng)的預(yù) 防和治療措施。
[0005] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0006] 本發(fā)明提供了一種人MARCO基因及其表達(dá)產(chǎn)物在制備診斷膽管癌的產(chǎn)品中的應(yīng) 用。
[0007] 進(jìn)一步，上面所提到的診斷產(chǎn)品包括：通過RT-PCR、實(shí)時(shí)定量PCR、免疫檢測(cè)、原位 雜交或芯片檢測(cè)MARCO基因及其表達(dá)產(chǎn)物的表達(dá)水平以診斷膽管癌的產(chǎn)品。
[0008] 進(jìn)一步，所述用RT-PCR診斷膽管癌的產(chǎn)品至少包括一對(duì)特異擴(kuò)增MARCO基因的引 物；所述用實(shí)時(shí)定量PCR診斷膽管癌的產(chǎn)品至少包括一對(duì)特異擴(kuò)增MARCO基因的引物；所 述用免疫檢測(cè)診斷膽管癌的產(chǎn)品包括：與MRCO蛋白特異性結(jié)合的抗體；所述用原位雜交 診斷膽管癌的產(chǎn)品包括：與MARCO基因的核酸序列雜交的探針；所述用芯片診斷膽管癌的 產(chǎn)品包括：蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白芯片包括與MARCO蛋白特異性結(jié)合的抗體，基 因芯片包括與MARCO基因的核酸序列雜交的探針。
[0009] 優(yōu)選地，所述產(chǎn)品包括芯片、試劑盒。
[0010] 本發(fā)明還提供了人MARCO基因在高通量測(cè)序平臺(tái)中的應(yīng)用。隨著高通量測(cè)序技術(shù) 的發(fā)展，對(duì)一個(gè)人的基因表達(dá)譜的構(gòu)建將成為十分便捷的工作。通過對(duì)比疾病患者和正常 人群的基因表達(dá)譜，容易分析出哪個(gè)基因的異常與疾病相關(guān)。因此，在高通量測(cè)序中獲知人 MARCO基因的異常與膽管癌相關(guān)也屬于人MARCO基因的用途，同樣在本發(fā)明的保護(hù)范圍之 內(nèi)。
[0011] 本發(fā)明還提供了人MARCO基因及其表達(dá)產(chǎn)物在制備治療膽管癌的藥物中的應(yīng)用。
[0012] 進(jìn)一步，所述藥物包括：含有人MARCO基因的藥物、攜帶人MARCO基因的載體或宿 主細(xì)胞所形成的藥物、人MARCO蛋白質(zhì)藥物、或其他能夠促進(jìn)MARCO基因表達(dá)的藥物。本發(fā) 明的藥物可以用于補(bǔ)充內(nèi)源性的人MARCO蛋白的缺失或不足，通過提高人MARCO蛋白的表 達(dá)，從而治療因人MARCO蛋白缺乏導(dǎo)致的膽管癌。
[0013] 本發(fā)明所述攜帶基因的載體是本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體、包括質(zhì)粒、 粘粒、噬菌體、病毒等。
[0014] 在本發(fā)明中，術(shù)語"宿主細(xì)胞"包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞。常用的原核宿主細(xì)胞的 例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞和哺乳動(dòng)物 細(xì)胞。較佳地，該宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞，如CHO細(xì)胞、COS細(xì)胞等。
[0015] 進(jìn)一步，本發(fā)明的藥物還包括藥學(xué)上可接受的載體，載體，這類載體包括（但并不 限于）：稀釋劑、賦形劑如水等、填充劑如淀粉、蔗糖等；粘合劑如纖維素衍生物、藻酸鹽、明 膠和聚乙烯吡咯烷酮；濕潤(rùn)劑如甘油；崩解劑如瓊脂、碳酸鈣和碳酸氫鈉；吸收促進(jìn)劑季銨 化合物；表面活性劑如十六烷醇；吸附載體如高嶺土和皂粘土；潤(rùn)滑劑如滑石粉、硬脂酸鈣 和鎂、聚乙二醇等。
[0016] 本發(fā)明的藥物導(dǎo)入組織或者細(xì)胞的方式可以分為體外或者體內(nèi)的方式。體外方式 包括將含有人MARCO基因的藥物或者含有人MARCO蛋白質(zhì)的藥物導(dǎo)入細(xì)胞中，再將細(xì)胞移 植或回輸?shù)襟w內(nèi)。體內(nèi)方式包括直接將含有人MARCO基因的藥物或者含有人MARCO蛋白質(zhì) 的藥物注入體內(nèi)組織中。
[0017] 本發(fā)明的藥物還可與其他治療膽管癌的藥物聯(lián)用，多種藥物聯(lián)合使用可以大大提 到治療的成功率。
[0018] 本發(fā)明還提供了一種診斷膽管癌的芯片，所述芯片包括基因芯片、蛋白質(zhì)芯片；所 述基因芯片包括固相載體以及固定在固相載體的寡核苷酸探針，所述寡核苷酸探針包括用 于檢測(cè)MARCO基因轉(zhuǎn)錄水平的針對(duì)MARCO基因的寡核苷酸探針；所述蛋白質(zhì)芯片包括固相 載體以及固定在固相載體的MRCO蛋白的特異性抗體。
[0019] 進(jìn)一步，所述基因芯片可用于檢測(cè)包括人MARCO基因在內(nèi)的多個(gè)基因（例如，與膽 管癌相關(guān)的多個(gè)基因）的表達(dá)水平。所述蛋白質(zhì)芯片可用于檢測(cè)包括人MRCO蛋白在內(nèi)的 多個(gè)蛋白質(zhì)（例如與膽管癌相關(guān)的多個(gè)蛋白質(zhì)）的表達(dá)水平。通過將多個(gè)與膽管癌的標(biāo)志 物同時(shí)檢測(cè)，可大大提高膽管癌診斷的準(zhǔn)確率。
[0020] 本發(fā)明提供了一種診斷膽管癌的試劑盒，所述試劑盒包括基因檢測(cè)試劑盒和蛋白 免疫檢測(cè)試劑盒；所述基因檢測(cè)試劑盒包括用于檢測(cè)MARCO基因轉(zhuǎn)錄水平的試劑；所述蛋 白免疫檢測(cè)試劑盒包括MRCO蛋白的特異性抗體。
[0021] 進(jìn)一步，所述試劑包括使用RT-PCR、實(shí)時(shí)定量PCR、免疫檢測(cè)、原位雜交或芯片方 法檢測(cè)MARCO基因表達(dá)水平過程中所需的試劑。優(yōu)選度，所述試劑包括針對(duì)MARCO基因的引 物和/或探針。根據(jù)SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列信息容易設(shè)計(jì)出可以用于檢測(cè)MARCO 基因表達(dá)水平的引物和探針。
[0022] 與MARCO基因的核酸序列雜交的探針可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合體、PNA或其 它衍生物。所述探針的長(zhǎng)度沒有限制，只要完成特異性雜交、與目的核苷酸序列特異性結(jié) 合，任何長(zhǎng)度都可以。所述探針的長(zhǎng)度可短至25、20、15、13或10個(gè)堿基長(zhǎng)度。同樣，所述 探針的長(zhǎng)度可長(zhǎng)至60、80、100、150、300個(gè)堿基對(duì)或更長(zhǎng)，甚至整個(gè)基因。由于不同的探針 長(zhǎng)度對(duì)雜交效率、信號(hào)特異性有不同的影響，所述探針的長(zhǎng)度通常至少是14個(gè)堿基對(duì)，最 長(zhǎng)一般不超過30個(gè)堿基對(duì)，與目的核苷酸序列互補(bǔ)的長(zhǎng)度以15-25個(gè)堿基對(duì)最佳。所述探 針自身互補(bǔ)序列最好少于4個(gè)堿基對(duì)，以免影響雜交效率。
[0023] 進(jìn)一步，所述MARCO蛋白的特異性抗體包括單克隆抗體、多克隆抗體。所述MARCO 蛋白的特異性抗體包括完整的抗體分子、抗體的任何片段或修飾（例如，，嵌合抗體、scFv、 Fab、F(ab'）2、Fv等。只要所述片段能夠保留與MARCO蛋白的結(jié)合能力即可。用于蛋白質(zhì) 水平的抗體的制備時(shí)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，并且本發(fā)明可以使用任何方法來制備所述抗 體。
[0024] 在本發(fā)明的上下文中，"MARCO基因"包括人MARCO基因以及人MARCO基因的任何功 能等同物的多核苷酸。MARCO基因包括與目前國(guó)際公共核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)GeneBank中MARCO 基因（NC_000002. 12)DNA序列具有70%以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列；
[0025] 優(yōu)選地，MARCO基因的編碼序列包括以下任 種DNA分子：
[0026] (1)序列表中SEQ ID NO. 1所示的DNA序列；
[0027] (2)在嚴(yán)格條件下與1)限定的DNA序列雜交且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列；
[0028] (3)與（1)或⑵限定的DNA序列具有70%、優(yōu)選地，90%以上同源性，且編碼相 同功能蛋白質(zhì)的DNA分子。
[0029] 在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所述MARCO基因的編碼序列是SEQ ID NO. 1所示的 DNA序列。
[0030] 在本發(fā)明的上下文中，MARCO基因表達(dá)產(chǎn)物包括人MARCO蛋白以及人MARCO蛋白 的部分肽。所述MRCO蛋白的部分肽含有與膽管癌相關(guān)的功能域。
[0031] "MARC0蛋白"包括人MARCO蛋白以及人MARCO蛋白的任何功能等同物。所述功 能等同物包括人MRCO蛋白保守性變異蛋白質(zhì)、或其活性片段，或其活性衍生物，等位變異 體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)緊條件下能與人MRCO的DNA雜交的DNA所編 碼的蛋白質(zhì)。
[0032] 優(yōu)選地，MARCO蛋白是具有下列氨基酸序列的蛋白質(zhì)：
[0033] (1)由序列表中SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
[0034] (2)將SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或 缺失和/或添加且與SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列具有相同功能的由SEQ ID NO. 2所示 的氨基酸序列衍生的蛋白質(zhì)。取代、缺失或者添加的氨基酸的個(gè)數(shù)通常為1-50個(gè)，較佳地 1-30個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè)。
[0035] (3)與SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列具有至少80%同源性（又稱為序列同一 性），更優(yōu)選地，與SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列至少約90%至95%的同源性，常為96%、 97%、98%、99%同源性的氨基酸序列構(gòu)成的多肽。
[0036] 在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所述MARCO蛋白是具有SEQ ID NO. 2所示的氨基酸 序列的蛋白質(zhì)。
[0037] 通常，已知的是，一個(gè)蛋白質(zhì)中一個(gè)或多個(gè)氨基酸的修飾不會(huì)影響蛋白質(zhì)的功能。 本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)可改變單個(gè)氨基酸或小百分比的氨基酸或?qū)Π被嵝蛄械膫€(gè)別添加、 缺失、插入、替換是保守修飾，其中蛋白質(zhì)的改變產(chǎn)生具有相似功能的蛋白質(zhì)。提供功能相 似的氨基酸的保守替換表是本領(lǐng)域公知的。
[0038] 通過添