本發(fā)明屬于基因工程和醫(yī)學(xué)檢測領(lǐng)域，涉及一種人結(jié)直腸癌分子標(biāo)志物COL3A1及其用途，尤其涉及其用于制備人結(jié)直腸癌檢測制劑或檢測試劑盒中的用途。
背景技術(shù)：
：根據(jù)世界衛(wèi)生組織GLOBOCAN2012的統(tǒng)計報道，結(jié)腸癌在世界范圍內(nèi)已成為第三大男性腫瘤和第二大女性腫瘤，其預(yù)后生存很差，其中，在2012年的整體致死率是50.1％(男性)和52.1％(女性)。腫瘤發(fā)并影響到個人家庭，并帶來嚴(yán)重的社會影響、增加公共衛(wèi)生支出和財政負(fù)擔(dān)。因此，早發(fā)現(xiàn)、早確證、早治療對于提高結(jié)腸癌的治愈率和延長預(yù)后生存時間具有非常重要的意義。研究顯示，結(jié)腸癌的初發(fā)階段一般癥狀不明顯，容易被忽略，一旦確診后則往往處于中晚期而使治療效果不佳，更影響手術(shù)后的生存。所以，與其他癌癥一樣治療結(jié)腸癌的一個關(guān)鍵在于盡可能早地發(fā)現(xiàn)癌。目前臨床實踐中，結(jié)腸癌的診斷通常包括觀察排便習(xí)慣的改變、便血、腹痛等，直腸指癥，實驗室檢查包括血常規(guī)、尿常規(guī)和大便常規(guī)、大便潛血試驗，影像檢查、B超、CT掃描、結(jié)腸鏡檢查等等；而血清血液檢查則是最為通行、常規(guī)的檢查，常用標(biāo)志物為癌胚抗原(CEA)、結(jié)直腸癌抗原(CCA)、CA19-9，但是這些抗原檢測的臨床效果差異比較大，且檢測的靈敏度和特異性有待提高。從這個意義上說，發(fā)現(xiàn)新的同時具有高靈敏度、高特異性的血液標(biāo)志物是一件非常緊迫的任務(wù)。利用新型標(biāo)志物，有望在常規(guī)體檢篩查中盡早地發(fā)現(xiàn)早期結(jié)腸癌的存在。其次，對于手術(shù)后或放化療后病人的預(yù)后效果、生存情況的預(yù)測，常規(guī)方法有賴于病理參數(shù)、TNM分期、Dukes分期等方法，但在病理判斷上時常有人為因素干擾，臨床實踐中需要有差異顯著、靈敏度高、特異性好、操作方便的分子標(biāo)志物作為輔助判斷手段，因此，尋找結(jié)腸癌的有效標(biāo)志物，準(zhǔn)確判斷結(jié)腸癌的臨床分期和預(yù)后成為廣大醫(yī)學(xué)研究者的迫切任務(wù)?；诂F(xiàn)有技術(shù)的現(xiàn)狀，本發(fā)明的申請人擬提供一種人結(jié)直腸癌分子標(biāo)志物COL3A1及其在制備人結(jié)直腸癌檢測制劑或檢測試劑盒中的用途。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種人結(jié)腸癌蛋白質(zhì)標(biāo)志物COL3A1用于制備人結(jié)直腸癌檢測制劑或檢測試劑盒中的用途，具體的，本發(fā)明提供了一種人結(jié)腸癌蛋白質(zhì)標(biāo)志物COL3A1用于制備診斷、預(yù)測、檢測或篩查人結(jié)腸癌的制劑；特別是用于制備診斷、預(yù)測、檢測或篩查人結(jié)腸癌的試劑盒。更進(jìn)一步的，本發(fā)明的人結(jié)腸癌蛋白質(zhì)標(biāo)志物COL3A1還可以用于制備診斷、預(yù)測、檢測或篩查人結(jié)腸癌癌細(xì)胞擴(kuò)散、結(jié)腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、結(jié)腸癌臨床分期、結(jié)腸癌患者預(yù)后的制劑；特別是用于制備診斷、預(yù)測、檢測或篩查人結(jié)腸癌癌細(xì)胞擴(kuò)散、結(jié)腸癌淋巳結(jié)轉(zhuǎn)移、結(jié)腸癌臨床分期、結(jié)腸癌患者預(yù)后的試劑盒。本發(fā)明所述的結(jié)腸癌蛋白質(zhì)標(biāo)志物COL3A1還可作為篩選制備診斷、緩解或治療結(jié)腸癌的藥劑的靶標(biāo)。本發(fā)明所述的試劑盒中包括特異性擴(kuò)增COL3A1的引物，或者針對COL3A1蛋白的抗體；所述的檢測試劑盒含有COL3A1標(biāo)準(zhǔn)品。另一方面，本發(fā)明還提供了一種人結(jié)腸癌標(biāo)志物COL3A1的檢測方法，其包括步驟:(a)分離提取樣本中的基因組DNA或者蛋白；和/或(b)檢測(a)所得的基因組DNA或者蛋白中COL3A1的含量。本發(fā)明中，實驗分析COL3A1基因在結(jié)腸癌和癌旁組織中的表達(dá)，結(jié)果表明，COL3A1基因在癌組織中相比于癌旁組織呈現(xiàn)顯著高表達(dá)趨勢，證明COL3A1在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展過程中起作用；進(jìn)一步檢測證明COL3A1蛋白主要與結(jié)腸癌細(xì)胞相關(guān)，尤其COL3A1蛋白在結(jié)腸癌和癌旁中，在上皮細(xì)胞中顯著差異表達(dá)，但在癌和癌旁的基質(zhì)部分，表達(dá)無差異，說明COL3A1蛋白是癌上皮細(xì)胞特異的分子標(biāo)志物；同時，COL3A1基因表達(dá)上調(diào)與腫瘤進(jìn)展呈正相關(guān)，其中男性病人COL3A1基因上調(diào)更明顯；而且，COL3A1基因和蛋白(上皮細(xì)胞)的高表達(dá)與結(jié)腸癌病人手術(shù)后的生存時間相關(guān)，該表達(dá)可作為結(jié)腸癌預(yù)后生存時間的參考判斷指標(biāo)及預(yù)后生存風(fēng)險預(yù)測參考依據(jù)。本發(fā)明提供了一個用于區(qū)分人結(jié)腸癌組織以及癌旁正常結(jié)腸組織、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移結(jié)腸癌組織和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移結(jié)腸癌組織的質(zhì)膜蛋白標(biāo)志物COL3A1，利用該標(biāo)志物制備判斷人結(jié)腸癌、結(jié)腸癌擴(kuò)散，結(jié)腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、結(jié)腸癌患者預(yù)后和預(yù)后的制劑。本發(fā)明為有效判斷人結(jié)腸癌癌變進(jìn)程提供了科學(xué)依據(jù)。附圖說明圖1是利用Oncomine公共數(shù)據(jù)庫中的基因表達(dá)芯片數(shù)據(jù)分析COL3A1基因在結(jié)直腸癌和正常結(jié)直腸組織中的表達(dá)，其中，圖1-A是利用GaedckeColorectal數(shù)據(jù)分析COL3A1在65對直腸和直腸癌組織中的表達(dá)的散點圖，散點下的數(shù)字表示病例或正常樣本的個數(shù)，p值為用Studentttest(T檢驗)分析得到的顯著性值，星號代表該T檢驗用的是配對T檢驗；圖1-B是利用HongColorectal數(shù)據(jù)分析COL3A1在12例結(jié)腸和70例結(jié)腸癌組織中的表達(dá)的散點圖；圖1-C是利用KaiserColon數(shù)據(jù)分析COL3A1在5例結(jié)腸和100例結(jié)腸癌組織中的表達(dá)的散點圖；圖1-D是利用SkrzypczakColorectal數(shù)據(jù)分析COL3A1在24例結(jié)腸、45例腺瘤和36例結(jié)腸癌組織中的表達(dá)的散點圖；圖1-E是利用SkrzypczakColorectal2數(shù)據(jù)分析COL3A1在20例結(jié)腸、10例腺瘤和10例結(jié)腸癌組織中的表達(dá)的散點圖；圖1-F是利用TCGAColorectal數(shù)據(jù)分析COL3A1在22例結(jié)直腸組織、22例盲腸腺癌組織、101例結(jié)腸腺癌、22例結(jié)腸粘液腺癌、60例結(jié)腸癌、6例直腸粘液腺癌和4例乙狀直腸腺癌中的表達(dá)的散點圖。圖2是用Westernblot方法檢測COL3A1蛋白在各個結(jié)腸癌細(xì)胞系中的表達(dá)。其中，GAPDH是內(nèi)參。圖3是利用商業(yè)化組織芯片進(jìn)行COL3A1免疫組織化學(xué)分析的結(jié)果，其中，圖3-A展示了COL3A1陰性表達(dá)的結(jié)腸組織；圖3-B是COL3A1陽性表達(dá)的癌旁結(jié)腸組織；圖3-C是COL3A1低表達(dá)的結(jié)腸癌組織；圖3-D是COL3A1高表達(dá)的結(jié)腸癌上皮細(xì)胞；圖3-E/F是COL3A1中低表達(dá)和高表達(dá)的結(jié)腸癌基質(zhì)；圖3-G是COL3A1高低表達(dá)的顏色標(biāo)記(用ImageScope軟件分析標(biāo)記)；圖3-H是COL3A1蛋白在正常結(jié)腸組織和結(jié)腸癌組織中的上皮細(xì)胞中表達(dá)差異統(tǒng)計；圖3-I是COL3A1蛋白在正常結(jié)腸組織和結(jié)腸癌組織中的基質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)差異統(tǒng)計。圖4是Kaplan-Meier曲線分析COL3A1的基因和蛋白表達(dá)與結(jié)腸癌生存的關(guān)系圖，其中，圖4-A是COL3A1基因表達(dá)與結(jié)腸癌病人總體生存的Kaplan-Meier曲線分析圖，基因表達(dá)數(shù)據(jù)來源于Oncomine基因表達(dá)公共數(shù)據(jù)庫；圖4-B是COL3A1基因表達(dá)與結(jié)腸癌病人無病生存的Kaplan-Meier曲線分析圖，基因表達(dá)數(shù)據(jù)來源于Oncomine基因表達(dá)公共數(shù)據(jù)庫；圖4-C是COL3A1蛋白在結(jié)腸癌組織中的上皮細(xì)胞表達(dá)與結(jié)腸癌病人總體生存的Kaplan-Meier曲線分析圖，圖4-D是COL3A1蛋白在結(jié)腸癌組織中的基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)與結(jié)腸癌病人總體生存的Kaplan-Meier曲線分析圖。圖5是COL3A1基因和蛋白檢測結(jié)腸癌的能力的分析，其中，圖5-A是ELISA分析結(jié)腸癌病人和正常人血漿中的COL3A1蛋白表達(dá)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的量測定COL3A1在病人和正常人血漿中的量，p值為用Studentttest(T檢驗)分析得到的顯著性值，N代表病例數(shù)；圖5-B是COL3A1蛋白血漿表達(dá)的受試者操作特性(ROC)曲線分析，橫坐標(biāo)代表假陽性或1-特異性，縱坐標(biāo)代表真陽性或靈敏度，對角線是參考線，AUC代表線下面積；圖5-C是COL3A1蛋白血漿表達(dá)的受試者操作特性(ROC)曲線分析，其中，圖5-DCOL3A1蛋白血漿表達(dá)的受試者操作特性(ROC)曲線分析；圖5-E是COL3A1蛋白血漿表達(dá)的受試者操作特性(ROC)曲線分析；圖5-F是COL3A1蛋白血漿表達(dá)的受試者操作特性(ROC)曲線分析。具體實施方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作詳細(xì)說明，而不會限制本發(fā)明。實施例1利用Oncomine公共數(shù)據(jù)庫(https://www.oncomine.org/resource/login.html)分析COL3A1基因在結(jié)腸癌和癌旁組織中的表達(dá)，分析方法：登錄上述Oncomine數(shù)據(jù)庫，輸入SPON2基因名，腫瘤類型選擇結(jié)腸癌，數(shù)據(jù)類型選擇mRNA，差異分析類型選擇癌和正常分析，繼而分析COL3A1基因在各個數(shù)據(jù)集中的表達(dá)情況，將各個數(shù)據(jù)集中COL3A1基因在癌和癌旁表達(dá)值分別下載、另行分析其表達(dá)的差異是否顯著；分析結(jié)果證明COL3A1基因在癌組織中相比于癌旁組織呈現(xiàn)顯著高表達(dá)趨勢，這被多個數(shù)據(jù)集的分析所證明，包括GaedckeColorectal(圖1-A，n＝65,p＝8.5E-13)、HongColorectal(圖-1B,n＝70,p＝0.037)、KaiserColon(圖-1C,n＝100,p＝0.029)、SkrzypczakColorectal2(圖-1D,n＝10,癌與癌旁比p＝0.003)和TCGAColorectal(圖-1E)。COL3A1在結(jié)腸腺瘤中上調(diào)，并且COL3A1基因在多種大腸癌組織中都顯著上升，如結(jié)腸腺癌、結(jié)腸粘液腺癌、盲腸腺癌、乙狀直腸腺癌和直腸粘液腺癌(圖-1E)。實施例2用Westernblot方法檢測COL3A1蛋白在結(jié)腸癌細(xì)胞系的表達(dá)，1、主要溶液配制：1)PBS溶液：量取生工20×PBS溶液25mL，超純水定容至500mL，室溫保存，2)50×Proteininhibitorcocktail(蛋白酶抑制劑母液)：取一粒羅氏蛋白酶抑制劑(completeEDTA-freeProteaseInhibitorcocktailtablets)，加入1mL超純水溶解，分裝，-20℃保存，此即為50×蛋白酶抑制劑母液，3)細(xì)胞裂解液：50mMTris-HCl(pH7.4)，1％SDS，2mMEDTA，分裝，-20℃保存，每毫升裂解液用時再加20μL50×Proteininhibitorcocktail，4)丙烯酰胺溶液：30％丙烯酰胺，0.8％甲叉雙丙烯酰胺，5)分離膠緩沖液：1.5mol/LTris-HClpH8.8，6)濃縮膠緩沖液：1.0mol/LTris-HClpH6.8，7)SDS：10％(m/v)，8)過硫酸氨AP：10％(m/v)，9)電泳緩沖液：25mmol/LTris，192mmol/L甘氨酸，0.1％(m/v)SDS，pH8.3，10)3×SDS凝膠加樣緩沖液：150mmol/LTris-HClpH6.8，300mmol/LDTT，6％SDS，0.3％溴酚藍(lán)，30％甘油，-20℃分裝保存，一般DTT現(xiàn)用現(xiàn)加，11)電轉(zhuǎn)緩沖液：25mmol/LTris，192mmol/L甘氨酸，12)TBST緩沖液：8.766gNaCl(即0.15mol/L)，1mLTween20，20mL1MTris-HCl(pH7.4)，加超純水定容到1L，13)封閉液：稱取5g脫脂奶粉溶解于100mLTBST中即為5％脫脂奶粉封閉液；2、培養(yǎng)細(xì)胞全蛋白的提取方法：1)用真空泵吸掉培養(yǎng)基，加入PBS洗一遍，吸掉，重復(fù)一次，2)將PBS吸掉，培養(yǎng)皿放到冰上，加入適量的細(xì)胞裂解液，靜置3min，3)充分裂解后，用干凈的細(xì)胞刮快速地將細(xì)胞刮至培養(yǎng)皿一側(cè)，然后用槍將細(xì)胞碎片和裂解液轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中，4)4℃12000g離心15min，5)將離心后的上清分裝轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中，-20℃保存；3、蛋白定量方法：BCA蛋白濃度測定試劑盒碧云天貨號:P00101)取BSA(Bio-rad)蛋白標(biāo)準(zhǔn)液，PBS稀釋至終濃度為0.5mg/mL，2)根據(jù)蛋白樣品數(shù)量，按50體積BCA試劑A加1體積BCA試劑B，即50:1配制適量BCA工作液，充分混勻，該BCA工作液室溫24h內(nèi)穩(wěn)定，3)將標(biāo)準(zhǔn)液按0，2，4，8，12，16，20μL加到96孔板的標(biāo)準(zhǔn)品孔中，加PBS補(bǔ)足到20μL，4)吸取2μL蛋白樣品到96孔板的樣品孔中，加PBS補(bǔ)足20μL，5)各孔加入200μLBCA工作液，37℃培養(yǎng)箱中放置30min，6)BioTekEpoch多體積分光光度計OD562nm處測定吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出樣品的蛋白濃度；4、SDS-PAGE凝膠電泳1)取成套Bio-Rad配膠用玻璃板ddH2O清洗干凈后于烘箱中烘干，用夾子固定在底座上，按以下配方配制10％分離膠和5％濃縮膠。制備分離膠時，上層用ddH2O封膠，室溫聚合40min以上；制備5％的濃縮膠時，將上層封膠ddH2O吸凈后，加入濃縮膠，插入梳子，并防止產(chǎn)生氣泡，10％分離膠配制如表1所示：濃縮膠配制如表2所示表1表22)待濃縮膠凝固后將凝膠板轉(zhuǎn)移至垂直電泳槽中，使凝膠板凹面向內(nèi)。加入電泳緩沖液，拔出梳子，3)已測濃度的蛋白樣品按體積比為2:1加入3×loadingbuffer，沸水中煮5min，12000g離心1min，上樣(上樣量為30μg/泳道)，同時上樣預(yù)染蛋白Marker，作為分子量對照，4)電泳：濃縮膠先以45V電壓進(jìn)行電泳，待溴酚藍(lán)指示劑進(jìn)入分離膠后轉(zhuǎn)換成65V繼續(xù)電泳，待指示劑跑至分離膠底部0.5cm左右停止電泳；5、轉(zhuǎn)膜及Westernblot1)即時準(zhǔn)備電轉(zhuǎn)緩沖液，根據(jù)凝膠大小，切割PVDF膜和濾紙，甲醇活化PVDF膜1min后，將PVDF膜和濾紙在電轉(zhuǎn)緩沖液中浸泡15min以上；2)撬開玻璃板，取出SDS-PAGE凝膠，放入電轉(zhuǎn)緩沖液中平衡，按黑板-海綿墊-濾紙-凝膠-PVDF膜-濾紙-海綿墊-白板的順序?qū)⒛z與PVDF膜固定于濕轉(zhuǎn)電轉(zhuǎn)夾內(nèi)，將夾子的黑面對應(yīng)槽的黑面方向放入電轉(zhuǎn)槽中，加滿電轉(zhuǎn)緩沖液進(jìn)行轉(zhuǎn)膜(冰浴)。通常使用110V2h電轉(zhuǎn)分子量較大的蛋白，也可在4℃冰箱中30V恒壓電轉(zhuǎn)過夜；3)封閉：轉(zhuǎn)膜結(jié)束后取出PVDF膜，將緊貼凝膠的一面(蛋白面)朝上放入孵育盒中，5％脫脂奶粉室溫封閉1h；4)一抗孵育：將抗COL3A1蛋白一抗(購自Sigma-Aldrich)用封閉液1:1000稀釋，4℃搖床上孵育過夜；5)TBST洗滌3次，每次5-10min；6)二抗孵育：將與一抗相對應(yīng)的羊抗兔二抗用封閉液稀釋到適當(dāng)濃度(1:5000-1:8000)，室溫?fù)u床上孵育1h；7)TBST洗滌3次，每次5-10min；8)剪取合適大小的封口膜，在上面加入200-400μLThermoSuperSignalWestFemtoMaximumSensitivitySubstrate超敏顯色液(按1:1現(xiàn)用現(xiàn)配工作液)，室溫靜置1min，使用Las-3000成像系統(tǒng)獲取Westernblot結(jié)果；；結(jié)果顯示：COL3A1蛋白在大部分所檢測的細(xì)胞系里有表達(dá)，包括結(jié)腸癌細(xì)胞系SW620、SW480、Caco-2、HCT-116、HT-29，只有LoVo例外；而在SW620、SW480、HCT-116中豐度比較高，證明COL3A1蛋白主要與結(jié)腸癌細(xì)胞相關(guān)(如圖-2所示)。實施例3用免疫組化方法分析COL3A1蛋白在結(jié)腸癌和癌旁正常組織中的表達(dá)1、組織芯片：使用商業(yè)化組織芯片(上海芯超生物公司)，HCol-Ade180Sur-04包括90例、180點癌和癌旁組織，臨床信息包括性別、年齡、TNM、腫瘤大小、分期、分級、隨訪信息等。芯片樣本點的直徑都為1.5mm，固定方式為福爾馬林固定；2、烘蠟1)將組織芯片放入烘箱中，溫度調(diào)至63度，烘蠟一小時；2)配制試劑：10×PBS緩沖液(配方：80gNaCl、2gKCl、15.35gNa2HPO4、2gKH2PO4，用純水定容至1000毫升)：將10×PBS緩沖液稀釋至1×PBS緩沖液，再在1×PBS緩沖液中加入占總體積0.05％的吐溫試劑；抗原修復(fù)液：82mL0.1mol/L的檸檬酸鈉溶液+18mL0.1mol/L的檸檬酸溶液+900mL的純水置于高壓鍋中；3、抗原修復(fù)1)片子烘烤完成后，從烘箱內(nèi)取出，放入全自動染色機(jī)中，進(jìn)行脫蠟；2)脫蠟過程：二甲苯兩缸，每缸15分鐘；無水乙醇兩缸，每缸7分鐘；90％酒精1缸，7分鐘；80％酒精1缸，7分鐘；70％酒精1缸，7分鐘；3)從染色機(jī)中取出片子，用純水沖洗3次，一次3分鐘。沖洗過程中將檸檬酸修復(fù)液放至電爐上開始加熱；4)抗原修復(fù)：檸檬酸修復(fù)液沸騰后，將片子放入高壓鍋中，蓋上高壓鍋蓋，待出氣后開始計時，5分鐘。時間到后終止加熱，將高壓鍋蓋打開，使其自然冷卻至室溫；4、阻斷配制內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑。38.4mL無水甲醇+12mL30％濃度的H2O2+9.6mL純水；將片子放入阻斷劑中10分鐘；5、加入一抗1)取出片子，用PBS緩沖液沖洗3次，一次5分鐘；2)冰箱中取出COL3A1抗體，放入離心機(jī)里7200轉(zhuǎn)離心30秒；3)取出抗體，按照稀釋度用DAKO抗體稀釋液1：800稀釋(稀釋度用預(yù)實驗確定，分別測試2種稀釋度)；4)滴加抗體；5)將濕盒放入冰箱，4℃過夜；6、加入二抗1)從冰箱里取出濕盒，靜置1小時待其恢復(fù)到室溫；2)將片子用PBS緩沖液沖洗3次，一次5分鐘；3)滴加EnVisionTM+/HRP兔工作液(來自DAKO公司)，30分鐘；4)時間到后用PBS沖洗3次，一次5分鐘；7、DAB顯色：從冰箱里取出DAB試劑盒，按1mLDAB稀釋液+1滴DAB色原進(jìn)行配制；(來自DAKO液體DAB+底物系統(tǒng))。在片子上滴加稀釋后的DAB，顯色5分鐘，到時后自來水沖洗15分鐘；8、蘇木素復(fù)染1)在片子上滴加蘇木素2分鐘，時間到后在0.25％的鹽酸酒精中浸沒2秒，用自來水沖洗2分鐘；2)將片子放入全自動染色機(jī)進(jìn)行脫水，取出封片；3)脫水過程：75％酒精1缸，3分鐘；85％酒精1缸，3分鐘；95％酒精1缸，3分鐘；無水乙醇兩缸，每缸5分鐘；二甲苯兩缸，每缸5分鐘；9、掃描：用芯片掃描儀ScanscopeXT(Aperio公司)掃描；10、芯片染色的軟件分析1)用軟件AperioImageScopev.12打開芯片掃描文件，用軟件的注釋工具，分別選取上皮細(xì)胞部分和基質(zhì)部分，將不需要的部分用反向選取工具剔除；有的樣本點，缺乏腫瘤上皮細(xì)胞，無法統(tǒng)計表達(dá)情況，這樣的點放棄；2)用軟件自帶的positivepixelcountalgorithm(v9.1)工具，采用默認(rèn)參數(shù)，計算選取部分的像素點及光密度值，像素點統(tǒng)計分為4類：陰性，弱陽性，陽性和強(qiáng)陽性。表達(dá)高低用軟件計算的陽性率表示，陽性率＝所有陽性像素點個數(shù)/(所有陽性像素點個數(shù)+所有陰性像素點個數(shù))；3)癌的上皮細(xì)胞，癌的基質(zhì)部分，癌旁的上皮細(xì)胞，癌旁的基質(zhì)部分，這4種組織部分分別統(tǒng)計；4)為比較，COL3A1蛋白表達(dá)按照陽性率的中位數(shù)分為2部分，即低表達(dá)和高表達(dá)；5)用GraphPadPrism6軟件作圖；結(jié)果顯示，癌旁COL3A1陰性表達(dá)的樣本如圖-3A所示，癌旁COL3A1陽性表達(dá)的樣本如圖-3B所示，結(jié)腸癌COL3A1陰性表達(dá)的樣本如圖-3C所示，結(jié)腸癌COL3A1高表達(dá)的樣本如圖3D所示，結(jié)腸癌基質(zhì)COL3A1低表達(dá)如圖-3E所示，結(jié)腸癌基質(zhì)COL3A1高性表達(dá)如圖-3F所示，圖3-G是圖3-D中的腫瘤組織，在ImageScope軟件注釋并用positivepixelcountalgorithm(v9.1)工具分析后生成的顏色標(biāo)記圖，紅色表示強(qiáng)陽性表達(dá)，橙色表示陽性表達(dá)，黃色表示弱陽性表達(dá)，藍(lán)色表示陰性表達(dá)，綠色虛線框住的區(qū)域，是分析上皮細(xì)胞表達(dá)時剔除的基質(zhì)區(qū)域；使用HCol-Ade180Sur-04組織芯片，在上皮區(qū)域表達(dá)分析中，有效的癌旁點是82例，有效的癌點是84例，經(jīng)T檢驗，顯示COL3A1蛋白在結(jié)腸癌樣本中的表達(dá)顯著高于癌旁正常組織(p＝3.4E-33，不配對t檢驗；p＝4.6E-22，配對t檢驗，n＝76)(如圖-3H所示)；在基質(zhì)區(qū)域分析中，有效的癌旁點是83例，有效的癌點是85例，經(jīng)T檢驗，顯示COL3A1蛋白在結(jié)腸癌樣本中的表達(dá)顯著高于癌旁正常組織(p＝0.3161，不配對t檢驗；p＝0.3353，配對t檢驗，n＝79)(如圖-3I所示)；結(jié)果表明，COL3A1蛋白在結(jié)腸癌和癌旁中，在上皮細(xì)胞中的表達(dá)是顯著差異表達(dá)，但在癌和癌旁的基質(zhì)部分，COL3A1蛋白表達(dá)無差異，說明COL3A1蛋白是癌上皮細(xì)胞特異的分子標(biāo)志物。實施例4COL3A1表達(dá)與結(jié)腸癌病人臨床參數(shù)的關(guān)系第一，COL3A1基因表達(dá)與結(jié)腸癌病人臨床參數(shù)顯著相關(guān)：用Oncomine基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫分析(獲取數(shù)據(jù)方法同前)，結(jié)腸癌樣本按照COL3A1基因的表達(dá)的中位數(shù)分為2組，一組為大于中位數(shù)的高表達(dá)組，一組為小于中位數(shù)的低表達(dá)組，用K平方法分析COL3A1基因的高、低表達(dá)與臨床參數(shù)的關(guān)系。所用軟件為PASWStatistics18；結(jié)果顯示：COL3A1基因的表達(dá)與分期(SmithColorectal,χ2＝10.468,p＝0.015)、T分期(BittnerColon,χ2＝10.073,p＝0.018)、Dukes分期(BittnerColon,χ2＝7.607,p＝0.022；JorissenColorectal3,χ2＝22.850,p＝0.000)、吸煙(BittnerColon,χ2＝4.523,p＝0.033)、性別(VilarColorectal2,χ2＝10.650,p＝0.014；JorissenColorectal3,χ2＝9.491,p＝0.050)、復(fù)發(fā)(SmithColorectal,χ2＝7.502,p＝0.006；JorissenColorectal3,χ2＝6.641,p＝0.008)和生存(SmithColorectal,χ2＝12.78,p＝0.000)有顯著關(guān)系(如表3所示)，總體上，COL3A1基因表達(dá)上調(diào)與腫瘤進(jìn)展呈正相關(guān)，男性病人COL3A1基因上調(diào)更明顯；表3.利用Oncomine數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)集分析COL3A1基因表達(dá)與結(jié)腸癌病人臨床病理參數(shù)的關(guān)系。第二，COL3A1蛋白表達(dá)也與結(jié)腸癌病人臨床參數(shù)顯著相關(guān)：根據(jù)組織芯片的免疫組化分析結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)COL3A1蛋白的表達(dá)與分級(χ2＝6.731,p＝0.02)、T分期(χ2＝6.923,p＝0.01)和分期(χ2＝8.438,p＝0.000)有顯著關(guān)系(如表4所示)；表4COL3A1蛋白表達(dá)與結(jié)腸癌病人臨床病理參數(shù)的關(guān)系(組織芯片的免疫組化分析)結(jié)果表明，COL3A1的基因高表達(dá)和蛋白高表達(dá)都與結(jié)腸癌的臨床參數(shù)相關(guān)，COL3A1具有結(jié)腸癌的分子標(biāo)志物的潛在作用。實施例5Kaplan-Meier方法分析COL3A1基因和蛋白的表達(dá)與結(jié)腸癌病人預(yù)后的關(guān)系第一，COL3A1基因高表達(dá)與結(jié)腸癌病人手術(shù)后預(yù)后不良顯著相關(guān)：利用Oncomine數(shù)據(jù)庫的基因表達(dá)數(shù)據(jù)集SmithColorectal分析COL3A1基因表達(dá)高低與手術(shù)后結(jié)腸癌病人的生存時間的關(guān)系，COL3A1基因的表達(dá)分為大于中位數(shù)(88例)和小于中位數(shù)(89例)兩組，用Kaplan-Meier曲線分析方法做圖，兩組數(shù)據(jù)顯著性用Log-rank檢驗方法來檢驗，結(jié)果證明COL3A1基因表達(dá)高的一組病人，其整體生存期(Overallsurvival)顯著縮短(Log-rank檢驗，p＝0.0029)(圖-4A)，低表達(dá)時的平均生存時間為103.805個月(預(yù)測值，標(biāo)準(zhǔn)誤6.544，置信區(qū)間90.978-116.632)，而高表達(dá)時的平均生存時間為71.019個月(預(yù)測值，標(biāo)準(zhǔn)誤6.140，置信區(qū)間58.985-83.053)；如果考慮復(fù)發(fā)的因素，統(tǒng)計無病生存率(Diseasefreesurvival)，則同樣COL3A1基因表達(dá)高的一組病人，其無病生存期也顯著縮短(Log-rank檢驗，p＝0.0252)(圖-4B)，低表達(dá)時的平均無病生存時間為91.411個月(預(yù)測值，標(biāo)準(zhǔn)誤7.286，置信區(qū)間77.131-105.692)，而高表達(dá)時的平均無病生存時間為66.951個月(預(yù)測值，標(biāo)準(zhǔn)誤6.031，置信區(qū)間55.131-78.770)；第二，COL3A1蛋白的高表達(dá)也與結(jié)腸癌病人的預(yù)后不良顯著相關(guān)：利用組織芯片進(jìn)行免疫組化分析，研究COL3A1蛋白與結(jié)腸癌病人預(yù)后生存的關(guān)系；COL3A1蛋白在腫瘤上皮細(xì)胞表達(dá)高的病人，其生存期比COL3A1蛋白在腫瘤上皮細(xì)胞表達(dá)低的病人顯著縮短(Log-rank檢驗，p＝0.0298)(圖-4C)；。COL3A1蛋白在腫瘤上皮細(xì)胞表達(dá)低的病人整體生存平均生存時間為72.129個月(預(yù)測值，標(biāo)準(zhǔn)誤6.081，置信區(qū)間60.210-84.048)，而COL3A1蛋白在腫瘤上皮細(xì)胞表達(dá)高的病人的平均整體生存時間為52.565個月(預(yù)測值，標(biāo)準(zhǔn)誤5.203，置信區(qū)間42.368-62.763)；作為對比，腫瘤和正常組織的基質(zhì)中的COL3A1蛋白表達(dá)高低，與結(jié)腸癌病人的預(yù)后無顯著相關(guān)性(Log-rank檢驗，p＝0.6693)(圖-4D)；實驗結(jié)果證明，COL3A1基因和蛋白(上皮細(xì)胞)的高表達(dá)縮短了結(jié)腸癌病人手術(shù)后的生存時間，COL3A1基因和蛋白(上皮細(xì)胞)的表達(dá)可以作為結(jié)腸癌預(yù)后生存時間的判斷指標(biāo)。實施例6單變量和多變量Cox回歸分析分析COL3A1基因和蛋白與預(yù)后風(fēng)險的關(guān)系第一、COL3A1基因與預(yù)后風(fēng)險有關(guān)，但不是獨立的風(fēng)險因素，利用Oncomine數(shù)據(jù)庫的基因表達(dá)數(shù)據(jù)集SmithColorectal分析COL3A1基因與結(jié)腸癌病人預(yù)后風(fēng)險的關(guān)系，單變量Cox回歸分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)與整體生存和無疾病生存的預(yù)后風(fēng)險顯著相關(guān)的因素包括COL3A1基因的高表達(dá)、高分級、有復(fù)發(fā)、高分期，多變量Cox回歸分析發(fā)現(xiàn)有復(fù)發(fā)、高分期是結(jié)腸癌病人預(yù)后的獨立風(fēng)險因素(如表5所示)；表5.COL3A1基因表達(dá)及其他臨床參數(shù)影響結(jié)腸癌病人整體生存及無疾病生存時間的單變量和多變量分析第一、COL3A1在上皮細(xì)胞中的表達(dá)與預(yù)后風(fēng)險有關(guān)，但不是獨立的風(fēng)險因素，本發(fā)明使用單變量和多變量Cox回歸方法，進(jìn)一步分析COL3A1蛋白(上皮細(xì)胞)表達(dá)及其他臨床參數(shù)與結(jié)腸癌病人生存風(fēng)險的關(guān)系，單變量Cox回歸分析結(jié)果表明，結(jié)腸癌病人的T分期(p＝0.018,風(fēng)險比1.889,95％置信區(qū)間1.259-2.834)、N分期(p＝0.000,風(fēng)險比＝1.534,95％置信區(qū)間＝1.266-1.859)、M分期(p＝0.000,風(fēng)險比＝10.484,95％置信區(qū)間＝3.075-35.747)、分期(p<0.001,風(fēng)險比＝1.311,95％置信區(qū)間＝1.147-1.499)、轉(zhuǎn)移(p＝0.002,風(fēng)險比＝10.123,95％置信區(qū)間＝2.294-44.664)和COL3A1蛋白(上皮細(xì)胞)表達(dá)(p＝0.030,風(fēng)險比＝2.053,95％置信區(qū)間＝1.071-3.935)與結(jié)腸癌預(yù)后風(fēng)險顯著相關(guān)(表6)；作為比較的是，基質(zhì)表達(dá)的COL3A1與預(yù)后風(fēng)險無顯著相關(guān)；多變量回歸分析表明，高的T、N、M分期顯著影響結(jié)腸癌病人的預(yù)后，增加預(yù)后風(fēng)險，是獨立的風(fēng)險因素；表6.COL3A1蛋白表達(dá)及其他臨床參數(shù)影響結(jié)腸癌病人生存時間的單變量和多變量分析(組織芯片及免疫組化分析)。結(jié)果表明，COL3A1蛋白(上皮細(xì)胞)表達(dá)是影響結(jié)腸癌病人生存的潛在風(fēng)險因素，單不是獨立風(fēng)險因素。通過檢測結(jié)腸癌病人癌組織中的COL3A1蛋白的表達(dá)，結(jié)合其他臨床指標(biāo)，就可以預(yù)測結(jié)腸癌病人的預(yù)后生存風(fēng)險情況。實施例7檢測結(jié)腸癌病人血液中的COL3A1蛋白的表達(dá)水平及其區(qū)分結(jié)腸癌病人與正常人的能力，COL3A1蛋白酶聯(lián)免疫試劑盒試劑盒(Cloud-CloneCorp公司產(chǎn)品)購自上海武昊公司。1、結(jié)腸癌病人68例，和正常人的血漿86例，其中結(jié)腸癌病人經(jīng)過手術(shù)確診；2、主要溶液配制：1)標(biāo)準(zhǔn)品(凍干品)稀釋：每瓶標(biāo)準(zhǔn)品加入標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液1mL，蓋好后室溫放置大約10分鐘，同時反復(fù)顛倒/搓動以助溶解，其濃度為10,000pg/mL(貯液)，然后再將其進(jìn)行梯度稀釋，依次稀釋成5,000pg/mL，2,500pg/mL,1,250pg/mL,625pg/mL,312pg/mL,156pg/mL,78pg/mL，標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液(0pg/mL)直接作為空白孔；2)血清樣本稀釋：稀釋10倍，取20μL血清或血漿加入180μLPBS；3)檢測溶液A及檢測溶液B配制：DetectionA及DetectionB使用前甩動使管壁或瓶蓋的液體沉積到管底，用前分別用去離子水以1:100稀釋(如：10μL檢測溶液A/990μL去離子水)，充分混勻，稀釋前根據(jù)計算好的每次實驗所需的總量配制(100μL/孔)，實際配制時應(yīng)多配制0.1-0.2mL；4)洗滌液：用580mL去離子水將20mL濃洗滌液稀釋至600mL，進(jìn)行30倍稀釋；3、操作步驟：1)加樣：分別設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔、空白孔。設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔7孔，依次加入100μL不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品?？瞻卓准?00μL標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，余孔加待測樣品100μL，酶標(biāo)板加上覆膜，37℃溫育2小時；2)棄去液體，甩干；3)每孔加檢測溶液A工作液100μL，酶標(biāo)板加上覆膜，37℃溫育1小時；4)棄去孔內(nèi)液體，每孔用350μL的洗滌液洗滌，浸泡1-2分鐘，甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體，在實驗臺鋪墊吸水紙，酶標(biāo)板朝下拍，重復(fù)洗板3次，洗滌后，甩干孔內(nèi)洗滌液；5)每孔加檢測溶液B工作液100μL，加上覆膜，37℃溫育30分鐘；6)棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，方法同步驟4；7)每孔加底物溶液90μL，酶標(biāo)板加上覆膜，37℃避光顯色20分鐘；8)每孔加終止溶液50μL，終止反應(yīng)；9)確保酶標(biāo)板底無水滴及孔內(nèi)無氣泡后，立即用酶標(biāo)儀在450nm波長測量各孔的光密度(O.D.值)；以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為縱坐標(biāo)，O.D.值為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；根據(jù)樣品O.D.值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度，乘以稀釋倍數(shù)(20倍)，即為樣品的實際濃度(ng/mL)；結(jié)果顯示：1)結(jié)腸癌病人及正常人血液中的COL3A1蛋白的表達(dá)水平酶聯(lián)免疫吸附檢測法測定了結(jié)腸癌病人及正常人血液中的COL3A1蛋白的表達(dá)水平，證明COL3A1蛋白在結(jié)腸癌病人(86例)血漿中的水平顯著高于正常人(68例)(p＝1.3E-10)(如圖-5A所示)，結(jié)腸癌病人血漿中COL3A1蛋白的平均濃度為159.2ng/mL，而正常人則為45.34ng/mL，病人遠(yuǎn)高于正常人；2)血漿中COL3A1蛋白的表達(dá)水平區(qū)分結(jié)腸癌病人與正常人的能力根據(jù)酶聯(lián)免疫吸附實驗的結(jié)果，利用受試者操作特征曲線分析，COL3A1蛋白的線下曲線面積(AUC)值為0.92(如圖-5B，表7所示)，說明COL3A1蛋白作為血漿標(biāo)志物可以很好地將結(jié)腸癌病人與正常健康人區(qū)分開來，COL3A1蛋白可以作為結(jié)腸癌診斷的血漿指標(biāo)；3)血漿COL3A1蛋白檢測結(jié)腸癌的靈敏度和特異性：根據(jù)酶聯(lián)免疫吸附實驗的結(jié)果，可以獲知血漿COL3A1蛋白檢測結(jié)腸癌的靈敏度和特異性，當(dāng)血漿COL3A1蛋白濃度為54.23ng/mL時，結(jié)腸癌檢測的靈敏度是98.8％，而特異性是69.1％(如表8所示)。表7.受試者特性曲線分析的曲線下的面積(AUC)。a.在非參數(shù)假設(shè)下，b.零假設(shè)：實面積＝0.5。表8顯示接受者操作特征曲線分析結(jié)腸癌病人及正常人血漿中COL3A1的表達(dá)檢測結(jié)腸癌的靈敏度和特異性，a最小界限值是最小觀測檢驗值減1，最大界限值是最大觀測檢驗值加1。所有其它的界限值都是兩個鄰近的觀測檢驗值的平均值。表8實施例8結(jié)腸癌病人癌組織中的COL3A1蛋白的表達(dá)水平及其區(qū)分結(jié)腸癌病人與正常人的能力利用組織芯片-免疫組化的結(jié)果，分析COL3A1在上皮細(xì)胞及基質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)在區(qū)分結(jié)腸癌病人與正常人的使用中的能力，方法：接受者操作特征曲線分析；結(jié)果顯示：利用受試者操作特征曲線分析，COL3A1蛋白(上皮表達(dá))的線下曲線面積(AUC)值為0.976(如圖-5C，表9所示)，說明COL3A1蛋白(上皮表達(dá))作為標(biāo)志物可以很好地將結(jié)腸癌病人與正常健康人區(qū)分開來，COL3A1蛋白(上皮表達(dá))可以作為結(jié)腸癌診斷的分子標(biāo)志物。表9.COL3A1蛋白(上皮表達(dá))受試者特性曲線分析的曲線下的面積(AUC)。a.在非參數(shù)假設(shè)下，b.零假設(shè)：實面積＝0.5，COL3A1蛋白(上皮表達(dá))檢測結(jié)腸癌的靈敏度和特異性：根據(jù)ROC分析的結(jié)果，可以獲知COL3A1蛋白(上皮表達(dá))檢測結(jié)腸癌的靈敏度和特異性，當(dāng)COL3A1蛋白(上皮表達(dá))的陽性率為82.09％時，結(jié)腸癌檢測的靈敏度是95.2％，而特異性是91.5％(表8)；表10顯示了接受者操作特征曲線分析結(jié)腸癌病人及正常人腫瘤中COL3A1(上皮表達(dá))的表達(dá)檢測結(jié)腸癌的靈敏度和特異性；a最小界限值是最小觀測檢驗值減1，最大界限值是最大觀測檢驗值加1。所有其它的界限值都是兩個鄰近的觀測檢驗值的平均值。表10與上皮表達(dá)相比，基質(zhì)表達(dá)的COL3A1診斷結(jié)腸癌效果較差，其AUC值為0.573(如圖5-D所示)，無診斷價值；結(jié)果表明：腫瘤上皮細(xì)胞表達(dá)的COL3A1蛋白具有診斷價值，AUC為0.976，比血漿中的COL3A1蛋白的AUC值高，并且靈敏度達(dá)95.2％(與血漿COL3A1相當(dāng))，而特異性為91.5％(比血漿COL3A1明顯好)。實施例9結(jié)腸癌病人癌組織中的COL3A1基因的表達(dá)水平及其區(qū)分結(jié)腸癌病人與正常人的能力利用Oncomine數(shù)據(jù)庫的基因表達(dá)數(shù)據(jù)集，分析COL3A1基因表達(dá)在區(qū)分結(jié)腸癌病人與正常人的使用中的能力，方法按接受者操作特征曲線分析。結(jié)果顯示：第一、利用GaedckeColorectal數(shù)據(jù)集，結(jié)腸癌65例，正常組織65例，受試者操作特征曲線分析，COL3A1基因的線下曲線面積(AUC)值為0.829(如圖-5E，表11所示)，說明COL3A1基因表達(dá)作為標(biāo)志物可以很好地將結(jié)腸癌病人與正常健康人區(qū)分開來，COL3A1基因可以作為結(jié)腸癌診斷的分子標(biāo)志物；表11.COL3A1蛋白(上皮表達(dá))受試者特性曲線分析的曲線下的面積(AUC)。a.在非參數(shù)假設(shè)下，b.零假設(shè)：實面積＝0.5；COL3A1基因(GaedckeColorectal數(shù)據(jù)集)檢測結(jié)腸癌的靈敏度和特異性：根據(jù)ROC分析的結(jié)果，獲知COL3A1基因檢測結(jié)腸癌的靈敏度和特異性，當(dāng)COL3A1基因的芯片檢測表達(dá)值為5.8時，結(jié)腸癌檢測的靈敏度是76.9％，而特異性是92.3％(如表12所示)。表12是接受者操作特征曲線分析結(jié)腸癌病人及正常人腫瘤中COL3A1基因表達(dá)檢測結(jié)腸癌的靈敏度和特異性；a最小界限值是最小觀測檢驗值減1，最大界限值是最大觀測檢驗值加1。所有其它的界限值都是兩個鄰近的觀測檢驗值的平均值。表12第二、利用TCGAColorectal數(shù)據(jù)集，結(jié)腸癌215例，正常組織22例，受試者操作特征曲線分析，COL3A1基因的線下曲線面積(AUC)值為0.863(如圖-5F，表13所示)，說明COL3A1基因表達(dá)作為標(biāo)志物可以很好地將結(jié)腸癌病人與正常健康人區(qū)分開來，COL3A1基因可以作為結(jié)腸癌診斷的分子標(biāo)志物。表13.COL3A1蛋白(上皮表達(dá))受試者特性曲線分析的曲線下的面積(AUC)a.在非參數(shù)假設(shè)下，b.零假設(shè)：實面積＝0.5，COL3A1基因(TCGAColorectal數(shù)據(jù)集)檢測結(jié)腸癌的靈敏度和特異性：根據(jù)ROC分析的結(jié)果，獲知COL3A1基因檢測結(jié)腸癌的靈敏度和特異性，當(dāng)COL3A1基因的芯片檢測表達(dá)值為6.0時，結(jié)腸癌檢測的靈敏度是82.8％，而特異性是81.8％(如表14所示)；表14顯示接受者操作特征曲線分析結(jié)腸癌病人及正常人腫瘤中COL3A1基因表達(dá)檢測結(jié)腸癌的靈敏度和特異性，a最小界限值是最小觀測檢驗值減1，最大界限值是最大觀測檢驗值加1，所有其它的界限值都是兩個鄰近的觀測檢驗值的平均值；表14結(jié)果說明，COL3A1基因表達(dá)可以作為結(jié)腸癌診斷的分子標(biāo)志物，結(jié)腸癌檢測的靈敏度是76.9％-82.8％，而特異性是81.8％-92.3％。當(dāng)前第1頁1 2 3