一種用于檢測克倫特羅或其衍生物的量子點免疫熒光試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種用于檢測克倫特羅或其衍生物的量子點免疫熒光試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 克倫特羅（CL)屬于苯乙醇胺類β -興奮劑，臨床醫(yī)學中主要用于擴張支氣管和增 加肺通氣量，可治療支氣管哮喘、阻塞性肺炎、平滑肌痙攣和休克等癥，在獸醫(yī)臨床中用作 牛、馬的產(chǎn)道松弛劑。近年來，克倫特羅作為飼料添加劑，在畜牧業(yè)非法使用的情況越來越 嚴重。
[0003] 多數(shù)國家都禁止在動物生產(chǎn)過程中使用克倫特羅。有些國家執(zhí)行最高殘留量 (MRLs)限制，如英國規(guī)定的MRLs為0. 5ng/g，荷蘭規(guī)定的MRLs為lng/g。我國明確規(guī)定禁 止CL及其制劑在食品動物的飼養(yǎng)過程中使用。
[0004] 目前檢測克倫特羅的方法主要有高效液相色譜法（HPLC-UV)、氣-質(zhì)聯(lián)機法 (GC-UV)和液-質(zhì)聯(lián)機等。這些方法都在不同程度地存在著處理過程繁瑣、凈化效果差、有 機溶劑浪費多、所需時間長等缺點。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種用于檢測克倫特羅或其衍生物的量子點免疫熒光試劑 盒。
[0006] 本發(fā)明首先保護一種抗體，是以式（I )所示的化合物與載體蛋白的偶聯(lián)物為免疫 原得到的抗體；
[0007]
[0008] 所述載體蛋白具體可為BSA或0VA。
[0009] 本發(fā)明還保護一種用于檢測克倫特羅或克倫特羅衍生物的試劑盒，包括所述抗 體。所述抗體具體可為兔源多克隆抗體。
[0010] 本發(fā)明還保護一種用于檢測克倫特羅或克倫特羅衍生物的量子點免疫熒光試劑 盒，包括量子點標記的所述抗體。
[0011] "量子點標記的所述抗體"的制備方法具體如下：
[0012] ①取2. 5mg量子點，用ρΗ4· 7、0· IM的MES緩沖液洗漆，然后用Iml ρΗ4· 7、0· IM的 MES 緩沖液重懸，加入 0· 96mg EDC 和 I. 15mg NHS，37°C反應(yīng) 30 分鐘，20000rpm 離心 5min， 收集沉淀，即為活化后的量子點；
[0013] ②取步驟①得到的活化后的量子點，用pH8. 5、50mM的硼砂緩沖液洗滌，然后將 2. 5mg活化后量子點、所述抗體(蛋白質(zhì)含量為0. 15mg)和pH8. 5、50mM的硼砂緩沖液混勻 (總體積為〇. 8ml)，25°C反應(yīng)3. 5小時；
[0014] ③取完成步驟②的液相，加入BSA并使其質(zhì)量百分含量為5%，37°C反應(yīng)30分鐘， 20000rpm離心5min，收集沉淀，用pH7. 4、0. 02M的PBS緩沖液洗滌，用Iml pH7. 4、0. 02M的 PBS緩沖液重懸；
[0015] ④取步驟③得到的液相，用ρΗ7· 4、0· 02M的PBS緩沖液稀釋至150000倍體積。
[0016] 本發(fā)明還保護以上任一所述試劑盒在檢測待測樣本中是否含有克倫特羅或克倫 特羅衍生物中的應(yīng)用。
[0017] 以上任一所述的克倫特羅衍生物具體可為鹽酸克倫特羅。
[0018] 本發(fā)明還保護式（I )所示的化合物與載體蛋白的偶聯(lián)物；
[0019]
[0020] 所述載體蛋白可為BSA或0VA。
[0021] 式（I )所示的化合物具體可為按如下方法制備得到的化合物：（1)取200mg鹽酸 克倫特羅、166mg碳酸鉀和15ml DMF，攪拌混勻，然后加入77μ L4-溴丁酸，90°C攪拌3h，自 然冷卻至室溫，加入50ml蒸餾水，用IM鹽酸水溶液調(diào)pH至6. 0 ; (2)取步驟（1)得到的溶 液，用乙酸乙酯萃取2次(每次可采用50ml乙酸乙酯)，合并有機相，用無水硫酸鈉干燥，過 濾并收集濾液，將濾液進行真空干燥，得到的干物質(zhì)即為式（I )所示的化合物。
[0022] 本發(fā)明提供的試劑盒操作簡便、特異性好、靈敏度高，各項性能優(yōu)良，非常適于推 廣應(yīng)用。
【附圖說明】
[0023] 圖1為量子點的掃描圖。
[0024] 圖2為標準曲線圖。
【具體實施方式】
[0025] 以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。以下實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，結(jié)果 取平均值。實施例1中的攪拌都是采用磁力攪拌器進行的。二甲基甲酰胺（DMF) :sigma， 型號：D4551。1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基）-碳化二亞胺（EDC) :sigma，型號：165344。 N-羥基琥珀酰亞胺（NHS) :sigma，型號：56480。鹽酸克倫特羅：sigma，型號：54969。
[0026] 克倫特羅的結(jié)構(gòu)式如下：
[0027]
[0028] 實施例1、免疫原和包被原的制備
[0029] -、半抗原的制備
[0030] 1、取200mg鹽酸克倫特羅、166mg碳酸鉀和15ml DMF，攪拌混勻，然后加入 77 μ L4-溴丁酸，90°C攪拌3h，自然冷卻至室溫，加入50ml蒸餾水，用IM鹽酸水溶液調(diào)pH 至 6. 0。
[0031] 2、取步驟1得到的溶液，用乙酸乙酯萃取2次(每次采用50ml乙酸乙酯)，合并有機 相，用無水硫酸鈉干燥，過濾并收集濾液，將濾液進行真空干燥，得到的干物質(zhì)即為半抗原。
[0032] 半抗原的結(jié)構(gòu)式見式（I )。
[0033]
[0034] 二、免疫原的制備
[0035] 1、取16. 2mg步驟一制備的半抗原，溶于2ml DMF，加入8. 6mg EDC和10. 4mg NHS， 室溫攪拌2h。
[0036] 2、取50mg BSA，溶于5ml0.1 M碳酸氫鈉水溶液。
[0037] 3、將步驟1得到的溶液逐滴加至步驟2得到的溶液中，室溫攪拌10小時，然后裝 入透析袋，在PBS緩沖液（pH7. 4、0. 01M)中進行透析（3天，每天換液2次)，得到的溶液即為 免疫原溶液。
[0038] 免疫原的結(jié)構(gòu)式見式（II)。
[0039]
[0040] 三、包被原的制備
[0041] 用OVA代替BSA，其它同步驟二，得到包被原溶液。
[0042] 實施例2、多克隆抗體的制備
[0043] 取實施例1制備的免疫原溶液，采用pH7. 4、0.0 lM的PBS緩沖液稀釋，得到免疫原 稀釋液，用于多克隆抗體的制備。采用新西蘭大白兔作為免疫動物。
[0044] 免疫過程如下(免疫劑量以蛋白量計）：
[0045] 首次免疫：將免疫原稀釋液與等體積的弗氏完全佐劑混合制成乳化劑，頸背部皮 下多點注射，免疫劑量為lmg/kg · b. w.;
[0046] 加強免疫：首次免疫4周后、8周后和12周后，各進彳了一次加強免疫，將免疫原 稀釋液與等體積的弗氏不完全佐劑混合乳化，頸背部皮下多點注射，單次免疫劑量為Img/ kg · b. w.；
[0047] 末次免疫：首次免疫16周后進行末次免疫，直接頸背部皮下多點注射免疫原稀釋 液，免疫劑量為lmg/kg · b.w.。
[0048] 末次免疫1周后，采血并分離血清，即為免疫原對應(yīng)的多克隆抗體(簡稱多克隆抗 體甲）。
[0049] 實施例3、量子點免疫熒光檢測試劑盒的組裝
[0050] 量子點購自深圳市泰勒斯科技有限公司，產(chǎn)品目錄號為TLSiLumi QD "203該 量子點的表征如下：粒徑為20nm、粒徑的CV為15%，量子產(chǎn)率為60%，表面羧基含量為 5 X l(T3mm〇l/mg，水溶性，CdSe/ZnS核殼結(jié)構(gòu)，激發(fā)光波長為345nm，發(fā)射波長是620nm ;紅色 熒光量子點。量子點的掃描圖如圖1所示。量子點上的羧基與蛋白質(zhì)上的氨基形成肽鍵并 連接起來。
[0051] 量子點免疫突光檢測試劑盒包括如下組件：
[0052] 1、包被了包被原的微孔板
[0053] 取實施例1制備的包被原溶液，用包被緩沖液稀釋(包被緩沖液即pH9. 6、0. 05M 的碳酸鹽緩沖液)，得到蛋白濃度為5ng/mL的包被原稀釋液。將IOg牛血清白蛋白、0.1 mL proclin300和1000 mL pH7. 4、0.0 lM的磷酸鹽緩沖液混合，得到封閉液。
[0054] (1)將包被原稀釋液加入微孔板（100 μ L/孔)，37°C孵育16小時。
[0055] (2)完成步驟（1)后，傾去孔內(nèi)的液體，洗漆，拍干。
[0056] (3)完成步驟（2)后，每孔加入200 μ L封閉液，37°C溫育2h。
[0057] ( 4)完成步驟（3 )后，傾去孔內(nèi)的液體，干燥后用鋁膜真空密封保存。
[0058] 2、量子點標記的多克隆抗體工作液
[0059] ①取2. 5mg量子點，用ρΗ4· 7、0· IM的MES緩沖液洗漆，然后用Iml ρΗ4· 7、0· IM的 MES 緩沖液重懸，加入 0· 96mg EDC 和 I. 15mg NHS，37°C反應(yīng) 30 分鐘，20000rpm 離心 5min， 收集沉淀，即為活化后的量子點。
[0060] ②取步驟①得到的活化后的量子點，用pH8. 5、50mM的硼砂緩沖液洗滌，然后將 2. 5mg活化后量子點、實施例2制備的多克隆抗體甲（蛋白質(zhì)含量為0. 15mg)和pH8. 5、50mM 的硼砂緩沖液混勻（總體積為〇. 8ml)，25°C反應(yīng)3. 5小時(多克隆抗體和量子點形成穩(wěn)定的 肽鍵共價結(jié)合)。
[0061] ③取完成步驟②的液相，加入BSA并使其質(zhì)量百分含量為5% (目的是對剩余活性 氨基位點進行封閉)，37°C反應(yīng)30分鐘，20000rpm離心5min，收集沉淀，用pH7. 4、0. 02M的 PBS緩沖液洗滌，用Iml pH7. 4、0. 02M的PBS緩沖液重懸，4°