綠萼梅甲酯取代的均聚半乳糖醛酸lem及其制備方法和用圖
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及中草藥提取多糖，更具體地說，涉及一種從綠萼梅中提取得到的一高 甲酯取代的均聚半乳糖醛酸LEM、其制備方法及在制備天然抑菌劑的應用。
【背景技術】
[0002] 隨著生活水平的提高，食品安全問題越來越引起人們的重視。在食品生產過程中， 為了延長食品的保質期，常需要添加防腐抗菌劑。據調查研宄，人們常用的苯甲酸鈉、山梨 酸鉀等化學添加劑具有致癌性、致畸性和易引起食物中毒等毒副作用。因而，廣譜、高效、安 全防腐抗菌劑的開發(fā)應用受到了人們的廣泛關注。多糖是構成生命的四大基本物質之一， 具有許多生物活性，包括抗感染、抗腫瘤、增強免疫、降血糖、抗病毒等作用。已有多項研宄 顯示多糖具有抑菌作用，甲酯其具有良好的生物相容性和生物無毒性等特性，是一種較為 理想的天然防腐抗菌劑。
[0003] 綠萼梅為薔薇科植物梅Prunus mume (Sieb. ) Sieb. et Zucc.的干燥花蕾。原產我 國西南及臺灣，主產江蘇和浙江，現在四川和湖北。綠萼梅味酸，澀，性平，歸肝、胃、肺經，具 有舒肝，和胃，化痰之功效。其花色潔白，香味極濃，有"花中君子"的美稱，最大特點就是能 夠理氣，調理脾胃，疏理氣血，但卻不會傷陰，老少皆宜，非常難得，常用于郁悶心煩、肝胃氣 痛、食欲不振等癥。此外，綠萼梅水外用還能預防面部血瘀形成斑點。多糖作綠萼梅生物活 性的重要組成部分，其結構及活性尚無報道。本發(fā)明在對綠萼梅多糖進行提取的基礎上，對 其結構及抑菌活性進行了測定，以期為綠萼梅多糖開發(fā)天然抑菌劑提供理論基礎。

【發(fā)明內容】

[0004] 本發(fā)明利用一種簡單有效的多糖提取工藝和方法，以綠萼梅為原料獲得了一種綠 萼梅多糖，其主要成分為半乳糖醛酸，具體為高甲酯取代的均聚半乳糖醛酸LEM(發(fā)明人定 義該多糖為LEM)，活性實驗表明高甲酯取代的均聚半乳糖醛酸LEM具有很好的抑菌效果。 其在制備抑菌作用的藥物及功能食品中具有潛在的應用價值。
[0005] 本發(fā)明的一個目的在于提供一種甲酯取代的均聚半乳糖醛酸LEM，其結構式如 下：
[0006]
[0007] 均聚半乳糖醛酸為只有半乳糖醛酸單一單糖重復組成的多糖，其中R為半乳糖醛 酸C6位的羥基被部分甲酯化。
[0008] 其中，所述甲酯取代的均聚半乳糖醛酸LEM的重均分子量范圍為I-IOOkDa ;優(yōu)選 為 l-50kDa ;更優(yōu)選為 3-10kDa ;
[0009] 本發(fā)明的另一目的是提供本所述的甲酯取代的均聚半乳糖醛酸LEM的制備方法， 其包括以下步驟：
[0010] a.多糖提取：干燥的綠萼梅經乙醇脫脂，加入去離子水，加熱條件下提取，過濾， 殘渣再次用去離子水提取，如此反復提取2-6次，濾液合并，加熱濃縮得濃縮液，加入3倍于 濃縮液體積的乙醇進行醇沉，離心得沉淀，沉淀經真空干燥得水提綠萼梅粗多糖。
[0011] b.多糖脫色：取綠萼梅粗多糖，水溶解，離心，上清用2M NaOH溶液調節(jié)pH至9. 0， 加入30%過氧化氫溶液至過氧化氫溶液終濃度為7%，攪拌脫色3h ;脫色結束后用鹽酸調 節(jié)溶液pH至中性，經透析除去溶液中的離子和小分子物質，冷凍干燥即得甲酯取代的均聚 半乳糖醛酸LEM。
[0012] 步驟a所述乙醇脫脂的過程為：按料液比（g/L)l:10-l:30的比例加入濃度為 65-85%，pH值2. 0-3. 0的乙醇溶液進行脫脂處理2-4次，脫脂條件為：水浴溫度60-80°C， 脫脂時間l_3h，然后擠壓除去乙醇。
[0013] 步驟a中干燥的綠萼梅與每次加入的去離子水的料液比（g/L)為1:10-1:30,加熱 條件下提取的加熱溫度95-100°C水浴中，每次提取1-3小時。
[0014] 步驟a中所述醇沉使用的乙醇為濃度95%的pH2. 0-3. 0的乙醇。
[0015] 在步驟b中，透析優(yōu)選為MW3500(截留分子量3500)的透析袋。
[0016] 本發(fā)明的又一目的是提供所述的甲酯取代的均聚半乳糖醛酸LEM的抑菌作用。
[0017] 本發(fā)明的又一目的是提供所述的甲酯取代的均聚半乳糖醛酸LEM在制備天然抑 菌劑中的用途。
【附圖說明】：
[0018] 圖1為所述甲酯取代的均聚半乳糖醛酸LEM的高效凝膠色譜圖；
[0019] 圖2為所述甲酯取代的均聚半乳糖醛酸LEM的13C-NMR譜圖；
[0020] 圖3為所述甲酯取代的均聚半乳糖醛酸LEM的HSQC譜圖；
[0021] 圖4為所述甲酯取代的均聚半乳糖醛酸LHM抑菌作用結果。
【具體實施方式】
[0022] 下面結合實施例對本發(fā)明作進一步的闡述，以下實施方式只以舉例的方式描述本 發(fā)明。很明顯，本領域普通技術人員可在本發(fā)明的范圍和實質內，對本發(fā)明進行各種變通和 修改。需要了解的是，本發(fā)明意欲涵蓋在所附權利要求中包括的變通和修改。
[0023] 實施例1 :綠萼梅高甲酯取代的均聚半乳糖醛酸LEM的制備
[0024] a.多糖提取：
[0025] 稱取綠萼梅200g，按料液比（g/L) 1:20的比例加入濃度為75%，pH值2.0的乙 醇溶液進行脫脂處理三次，脫脂條件為：水浴溫度70°C，脫脂時間2h ;上述脫脂后的綠萼梅 經擠壓除去內部殘留乙醇溶液，再加入蒸餾水4L，96°C水浴中攪拌提取三次，每次提取3小 時，共提取3次；三次濾液合并，減壓濃縮至200mL ;濃縮液邊攪拌邊緩慢加入三倍體積的 95%乙醇溶液（pH值2. 0)進行醇沉，室溫靜置3-4h ;上述溶液經1000 rpm離心收集沉淀， 沉淀物再以少量無水乙醇洗滌三次；沉淀物置85°C烘箱干燥得綠萼梅粗多糖。其中：pH = 2. 0的乙醇是用鹽酸將乙醇的pH調節(jié)至2-3制得。
[0026] b.多糖脫色：
[0027] 干燥的綠萼梅粗多糖以料液比I :100加水攪拌溶解，離心棄去沉淀；上清用2M NaOH溶液調節(jié)pH至9. 0，加入30 %過氧化氫溶液至過氧化氫溶液終濃度為7 %，攪拌脫色 3h;脫色結束后用鹽酸調節(jié)溶液pH至中性，經透析（透析袋，MW 3500)除去溶液中的離子 和小分子物質，冷凍干燥即得所述甲酯取代的均聚半乳糖醛酸LEM。
[0028] c.多糖結構鑒定：
[0029] 經高效凝膠滲透色譜法（HPGPC)測定所述甲酯取代的均聚半乳糖醛酸LEM相對分 子質量為6. 9kDa。將其進行單糖組成分析，即將多糖完全水解、PMP衍生化，萃取、濃縮后送 入高效液相色譜分析。單糖組成分析結果顯示，其主要含半乳糖醛酸。結合核磁共振分析 (參見圖2和圖3)，確定LEM為一高甲酯取代的均聚半乳糖醛酸。
[0030] d.多糖結構解析：
[0031] 經高效凝膠色譜法析（HPGPC)分析表明LEM的分子量為6. 9kDa。單糖組成分析 表明LEM主要含有半乳糖醛酸。13C-NMR譜中（圖2)，位于δ 101. 64及δ 100. 80的端基 碳信號，分別為甲基取代的半乳糖醛酸Cl信號及未取代的半乳糖醛酸Cl信號；δ 69. 84， 3 69.01，6 80.25和6 71.94分別為〇2，〇3，〇4，〇5的信號。此外，在6 54.14處在54.59口口111 處具有明顯的糖醛酸羧基甲酯化的甲基碳原子信號，在δ 171. 99處為甲酯化的半乳糖醛 酸C6的信號峰。從上述結果可以發(fā)現LEM為一高甲酯取代的均聚半乳糖醛酸。
[0032] 實施例2.綠萼梅多糖LEM抑菌實驗
[0033] 1)檢定菌：接Newman (Staphylococcus aureus)單克隆于TSB培養(yǎng)基中振搖過 夜，接MPAOl (Pseudomonas aeruginosa)單克隆于LB培養(yǎng)基中振搖過夜。過夜培養(yǎng)的菌 稀釋至 I 0D(Newman:108cfu/ml/MPA01:109cfu/ml)左右備用。
[0034] 2)檢定平板的制備：分別向TSA/LB平板上均勻涂布50 μ 1稀釋好的檢定菌備用。
[0035] 3)樣品的加入：于檢定平板上滴加樣品10 μ 1，并滴加10 μ 1無菌dd H2O作為陰 性對照，樣品滴加后于無菌臺中吹干。
[0036] 4)檢定平板的培養(yǎng)：檢定平板于37°C培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)12_24h后觀察結果。
[0037] 實驗結果表明，該綠萼梅甲酯取代的均聚半乳糖醛酸LEM能顯著抑制金黃色葡萄 球菌的生長（見圖4)，可作為潛在的天然抑菌劑開發(fā)利用。
【主權項】
1. 一種綠萼梅高甲酯取代的均聚半乳糖醛酸LEM，其化學結構式為：R = OMe 或 0H，酯化度為 50-100 %。 ，2. 如權利要求1所述的甲酯取代的均聚半乳糖醛酸LEM，其特征在于：重均分子量范圍 為 I-IOOkDa ;優(yōu)選為 l-50kDa ;更優(yōu)選為 3-10kDa。3. 權利要求1或2所述的甲酯取代的均聚半乳糖醛酸LEM的制備方法，其特征在于，包 括以下步驟： a. 多糖提?。焊稍锏木G萼梅經乙醇脫脂，加入去離子水，加熱條件下提取，過濾，殘渣 再次用去離子水提取，如此反復提取2-6次，濾液合并，加熱濃縮得濃縮液，加入3倍于濃縮 液體積的乙醇進行醇沉，離心得沉淀，沉淀經真空干燥得水提綠萼梅粗多糖； b. 多糖脫色：取綠萼梅粗多糖，水溶解，離心，上清用2M NaOH溶液調節(jié)pH至9.0,加入 30%過氧化氫溶液至過氧化氫溶液終濃度為7%，攪拌脫色3h ;脫色結束后用鹽酸調節(jié)溶 液pH至中性，經透析除去溶液中的離子和小分子物質，冷凍干燥即得甲酯取代的均聚半乳 糖醛酸LEM。4. 根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于：步驟a所述乙醇脫脂的過程為：按料 液比（g/L) 1:10-1:30的比例加入濃度為65-85 %，pH值2. 0-3. 0的乙醇溶液進行脫脂處理 2-4次，脫脂條件為：水浴溫度60-80°C，脫脂時間l_3h，然后擠壓除去乙醇。5. 根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于：步驟a中干燥的綠萼梅與每次加入 的去離子水的料液比（g/L)為1:10-1:30,加熱條件下提取的加熱溫度95-100°C水浴中，每 次提取1-3小時。6. 根據權利要求1或2所述的綠萼梅甲酯取代的均聚半乳糖醛酸LEM在制備天然抑菌 劑的用途。
【專利摘要】本發(fā)明提供了從綠萼梅中獲得的高甲酯取代均聚半乳糖醛酸LEM、其制備方法和抑菌用途。具體而言，首先從綠萼梅中提取粗多糖，經過氧化氫脫色后，通過色譜及波譜鑒定后得一高甲酯取代均聚半乳糖醛酸LEM。生物活性實驗表明該多糖具有抑制金黃色葡糖球菌生長的作用，具有潛在的制備天然抑菌劑的用途。
【IPC分類】A01P1/00, A61P31/10, A01P3/00, A23L1/09, A61K31/715, A61P31/04, A01N43/16, C08B37/00
【公開號】CN104892786
【申請?zhí)枴緾N201510299821
【發(fā)明人】丁侃, 王培培, 董艷萍, 姚健
【申請人】中國科學院上海藥物研究所
【公開日】2015年9月9日
【申請日】2015年6月3日