基于三維細(xì)胞培養(yǎng)的3d細(xì)胞培養(yǎng)基及其建立遺傳毒性檢測(cè)體系的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及的是一種細(xì)胞遺傳檢測(cè)的技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及的是一種基于三維細(xì)胞 培養(yǎng)的3D細(xì)胞培養(yǎng)基及其建立遺傳毒性檢測(cè)體系的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] A#田胞是人成纖維細(xì)胞與中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞（CHO)雜交后所得到的永生化細(xì)胞， 包含一條單拷貝的人11號(hào)染色體和整套中國(guó)倉(cāng)鼠染色體。該細(xì)胞作為一種遺傳毒性檢測(cè) 體系對(duì)誘變劑種類沒(méi)有選擇特異性，且相比于其他突變檢測(cè)體系更加靈敏（Hei TK，Piao CQ,He ZY1Vannais D1Waldren CA. Chrysotile fiber is a strong mutagen in mammalian cells[J]· Cancer Res, 1992, 52(22) :6305-6309)。然而，該遺傳毒性檢測(cè)體系是在二維 (2D)培養(yǎng)條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，難以準(zhǔn)確反映誘變劑對(duì)體內(nèi)細(xì)胞突變的影響。
[0003] 隨著細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，研宄發(fā)現(xiàn)由于體外培養(yǎng)條件與體內(nèi)環(huán)境差異較大，細(xì) 胞在體外培養(yǎng)時(shí)，形態(tài)和功能會(huì)發(fā)生一定程度的改變，導(dǎo)致以2D細(xì)胞培養(yǎng)為基礎(chǔ)的藥物或 生物學(xué)研宄出現(xiàn)偏差，并且難以預(yù)測(cè)細(xì)胞在體內(nèi)的真實(shí)活動(dòng)信息。為了減少這種差異性，三 維（3D)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)得以提出。使用這種培養(yǎng)技術(shù)可以讓細(xì)胞聚集生長(zhǎng)，形成組織樣結(jié) 構(gòu)，這樣有助于細(xì)胞之間緊密連接，促進(jìn)細(xì)胞間的信息交流，可以為研宄提供更真實(shí)的細(xì)胞 信息。
[0004] 判斷3D細(xì)胞的構(gòu)建情況，可通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞團(tuán)形態(tài)、數(shù)目、直徑、干性相關(guān)基因的表 達(dá)量來(lái)確定。其中檢測(cè)細(xì)胞干性相關(guān)基因是由于多能干細(xì)胞傾向于形成團(tuán)塊或集落形態(tài)， 并且細(xì)胞團(tuán)塊的形成可能與細(xì)胞干性有關(guān)，相關(guān)研宄也證明了這點(diǎn)。例如，懸浮培養(yǎng)的神經(jīng) 祖細(xì)胞（NPCs)會(huì)形成神經(jīng)球，培養(yǎng)成細(xì)胞團(tuán)狀的間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC)能夠保持干性標(biāo)記基 因的表達(dá)。而3D細(xì)胞在培養(yǎng)期間會(huì)聚集成團(tuán)，影響有關(guān)細(xì)胞干性相關(guān)基因（Nanog、0ct4、 Klf4、Sox2、Lin28等）的表達(dá)，因此通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞干性相關(guān)基因，可以幫助判斷3D細(xì)胞的 構(gòu)建情況。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種基于三維細(xì)胞培養(yǎng)的3D細(xì) 胞培養(yǎng)基及其建立遺傳毒性檢測(cè)體系的方法，以解決二維（2D)培養(yǎng)條件下，細(xì)胞的形態(tài)和 功能會(huì)發(fā)生一定程度的改變，導(dǎo)致以2D細(xì)胞培養(yǎng)為基礎(chǔ)的藥物或生物學(xué)研宄出現(xiàn)偏差，并 且難以預(yù)測(cè)細(xì)胞在體內(nèi)的真實(shí)活動(dòng)信息。
[0006] 本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0007] -種基于三維細(xì)胞培養(yǎng)的3D細(xì)胞培養(yǎng)基，所述3D培養(yǎng)基為由預(yù)熱的無(wú)菌的 2XHam' s F12培養(yǎng)液與預(yù)熱的無(wú)菌的質(zhì)量比為1 %的瓊脂糖溶液按照1 :1體積比混合制 成。
[0008] -種利用上述的基于三維細(xì)胞培養(yǎng)的3D細(xì)胞培養(yǎng)基建立遺傳毒性檢測(cè)體系的方 法，包括以下步驟：
[0009] (1)制備3D細(xì)胞培養(yǎng)基
[0010] 將預(yù)熱的無(wú)菌的2XHam' s F12培養(yǎng)液與預(yù)熱的無(wú)菌的質(zhì)量比為1%的瓊脂糖溶 液按照1 :1體積比混合，鋪在培養(yǎng)皿中，待冷卻后，獲得膠狀Ham' S F12培養(yǎng)基，即為3D細(xì) 胞培養(yǎng)基；
[0011] (2)AL3D細(xì)胞的培養(yǎng)
[0012] 步驟一、將\細(xì)胞接種于3D細(xì)胞培養(yǎng)基中，置于CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
[0013] 步驟二、每2天換液一次，具體步驟為：將培養(yǎng)的\細(xì)胞離心，去上清，加入新鮮的 無(wú)菌的Ham' s F12完全培養(yǎng)液混勻，重新接種在3D細(xì)胞培養(yǎng)基上；
[0014] 步驟三、培養(yǎng)若干天后，獲得3D細(xì)胞的遺傳毒性檢測(cè)體系。
[0015] 所述步驟⑴中，膠狀Ham' s F12培養(yǎng)基在培養(yǎng)皿中的鋪設(shè)厚度為4mm。
[0016] 所述步驟一中，Ajffl胞的接種量為3X 10 6個(gè)。
[0017] 所述步驟一中，置于CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)的條件為：37°C，C02含量為5%體積比。
[0018] 所述步驟二中，A1細(xì)胞離心的條件為：1000 g下離心3min。
[0019] 所述步驟三中，培養(yǎng)5~7天，獲得3D細(xì)胞的遺傳毒性檢測(cè)體系。
[0020] 所述基于三維細(xì)胞的遺傳毒性檢測(cè)體系的建立方法中，所述步驟（2)之后還包括 步驟（3) 3D細(xì)胞的遺傳毒性檢測(cè)體系的檢測(cè)步驟，所述檢測(cè)步驟包括3D細(xì)胞特性指標(biāo)檢測(cè) 和體系靈敏性檢測(cè)。
[0021] 所述3D細(xì)胞特性指標(biāo)檢測(cè)包括3D細(xì)胞形態(tài)、直徑、細(xì)胞數(shù)、細(xì)胞活性、本底基因突 變率和基因表達(dá)量檢測(cè)，所述體系靈敏性檢測(cè)包括誘變劑處理的基因突變率檢測(cè)。
[0022] 本發(fā)明的原理是：貼壁細(xì)胞在培養(yǎng)皿中生長(zhǎng)，會(huì)緊緊貼在細(xì)胞培養(yǎng)皿上，細(xì)胞呈現(xiàn) 二維生長(zhǎng)，這種培養(yǎng)方法的培養(yǎng)環(huán)境與體內(nèi)環(huán)境差異較大，但通過(guò)瓊脂糖膠培養(yǎng)皿培養(yǎng)后， 細(xì)胞并不貼壁，而是懸浮在培養(yǎng)液中，細(xì)胞在培養(yǎng)液中聚集生長(zhǎng)，形成組織樣結(jié)構(gòu)，這樣有 助于細(xì)胞間緊密連接，促進(jìn)細(xì)胞間的信息交流，從而減小培養(yǎng)環(huán)境與體內(nèi)環(huán)境的差異性，模 擬體內(nèi)細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境。
[0023] 本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明提供了一種基于三維細(xì)胞培養(yǎng)的3D 細(xì)胞培養(yǎng)基及其建立遺傳毒性檢測(cè)體系的方法，該方法將二維生長(zhǎng)的\細(xì)胞培養(yǎng)成三維生 長(zhǎng)的\3D細(xì)胞團(tuán)，這種3D細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)既能模擬體內(nèi)細(xì)胞微環(huán)境的生長(zhǎng)條件基礎(chǔ)，又能體 現(xiàn)傳統(tǒng)2D細(xì)胞培養(yǎng)的條件可控制性及直觀性，可以將2D細(xì)胞培養(yǎng)體系與組織器官研宄聯(lián) 系起來(lái)，從而有效模擬誘變劑對(duì)體內(nèi)細(xì)胞突變的影響，對(duì)誘變?cè)囼?yàn)的評(píng)價(jià)更加準(zhǔn)確；同時(shí)， 利用本發(fā)明所述的方法培養(yǎng)數(shù)天的細(xì)胞，其細(xì)胞團(tuán)結(jié)構(gòu)更加緊密，培養(yǎng)期間，通過(guò)檢測(cè)3D 細(xì)胞的形態(tài)、3D細(xì)胞的直徑大小、每個(gè)細(xì)胞團(tuán)內(nèi)的細(xì)胞數(shù)目、3D細(xì)胞的細(xì)胞活性、CD59基因 突變數(shù)、3D細(xì)胞基因的表達(dá)量等來(lái)觀察3D細(xì)胞構(gòu)建情況，與其它3D細(xì)胞構(gòu)建方法相比，本 發(fā)明既不需特殊的3D細(xì)胞培養(yǎng)裝置，也不需要昂貴的生長(zhǎng)因子等添加劑，3D細(xì)胞培養(yǎng)的生 物反應(yīng)裝置簡(jiǎn)單，極大地降低了實(shí)驗(yàn)的成本，同時(shí)實(shí)驗(yàn)易于操作，適合小規(guī)模3D細(xì)胞培養(yǎng) 用。
【附圖說(shuō)明】
[0024] 圖1為3D細(xì)胞遺傳毒性檢測(cè)體系的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0025] 圖2為經(jīng)過(guò)培養(yǎng)后得到的\3D細(xì)胞的DIC顯微鏡觀察圖；
[0026] 圖3為不同培養(yǎng)天數(shù)下\3D細(xì)胞團(tuán)的直徑大小結(jié)果圖；
[0027] 圖4為不同培養(yǎng)天數(shù)下每個(gè)\30細(xì)胞團(tuán)中含有的細(xì)胞數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果圖；
[0028] 圖5為不同培養(yǎng)天數(shù)下\3D細(xì)胞中⑶59基因突變率柱狀圖；
[0029] 圖6為不同培養(yǎng)天數(shù)下\3D細(xì)胞活性柱狀圖；
[0030] 圖7為不同培養(yǎng)天數(shù)下\3D細(xì)胞的基因表達(dá)量結(jié)果柱狀圖；
[0031] 圖8為不同培養(yǎng)天數(shù)下\3D細(xì)胞的突變靈敏度結(jié)果柱狀圖。
【具體實(shí)施方式】
[0032] 下面對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說(shuō)明，本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行 實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過(guò)程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施 例。
[0033] 實(shí)施例1
[0034] 1、試驗(yàn)材料
[0035] 1. 1、無(wú)菌的 2 倍濃度的 Ham' s F12(2XHam' s F12)培養(yǎng)液：10. 63g 的 F12 培養(yǎng) 基粉末（購(gòu)于上?？婆d商貿(mào)有限公司）溶于500ml CldH2O中，加入I. 176g的NaHCO3粉末， 并調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH值至7. 0~7. 2,在攪拌器上加轉(zhuǎn)子，邊加熱邊攪拌溶解，過(guò)濾滅菌。；
[0036] 1. 2、無(wú)菌的Ham's F12完全培養(yǎng)液：10. 63g的Ham's F12培養(yǎng)基粉末溶于1000 ml 的CldH2O中，加入I. 176g的NaHCO3粉末，并調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH值至7. 0~7. 2,在攪拌器上加轉(zhuǎn) 子，邊加熱邊攪拌溶解，過(guò)濾滅菌；再加入體積比為8%的胎牛血清，2 X KT4M的甘氨酸（將 4. 5ml的甘氨酸溶于1000 ml的CldH2O中配制獲得），25ug/ml的慶大霉素（將625ul的慶大 霉素溶于1000 ml的CldH 2O中配制獲得），混勻。
[0037] 1. 3、無(wú)菌的質(zhì)量比為1 %的瓊脂糖溶液；
[0038] 1. 4、CD59突變體系的\細(xì)胞：參見Τ. T. PUCK等人1971年11月在PNAS雜志上 發(fā)表的論文（Τ· T. PUCK，et. Genetics of Somatic Mammalian Cells: Lethal Antigens as Genetic Markers for Study of Human Linkage Groups? Proc. Nat. Acad. Sci. USA Vol. 6 8, No. 12, pp. 3102-3106, Decemberl971)
[0039] 2、試驗(yàn)方法：
[0040] 2. I、制備3D細(xì)胞培養(yǎng)皿
[0041] 將預(yù)熱的無(wú)菌的2XHam' s F12培養(yǎng)液與預(yù)熱的無(wú)菌的質(zhì)量比為1%的瓊脂糖溶 液按照I : 1體積比混合，鋪在直徑為60mm的培養(yǎng)皿中，待冷卻后，獲得4_厚的膠狀Ham'S F12培養(yǎng)基，即為3D細(xì)胞培養(yǎng)皿。
[0042] 2. 2、AJD細(xì)胞的培養(yǎng)
[0043] 步驟一、將3X IO6個(gè)A #田胞接種于3D細(xì)胞培養(yǎng)皿中，置于37°C含5% (體積比） 的CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2天；
[0044] 步驟二、每2天換液一次，具體步驟為：將培養(yǎng)的\細(xì)胞離心，去上清，加入新鮮的 無(wú)菌的Ham' s F12培養(yǎng)液混勻，重新接種在3D細(xì)胞培養(yǎng)基上；
[0045] 步驟三、培養(yǎng)5~7天后，獲得如圖1所示的3D細(xì)胞的遺傳毒性檢測(cè)體系，圖中， 1為培養(yǎng)皿，2為Ham's F12培養(yǎng)液，3為培養(yǎng)皿底層形成的膠狀物質(zhì)，41為\30細(xì)胞團(tuán)，42 為未成團(tuán)的\單細(xì)胞。
[0046] 2. 3、AJD細(xì)胞團(tuán)直徑的測(cè)量
[0047] 將\3D細(xì)胞通過(guò)孔徑為40 μ m的篩網(wǎng)，篩去未成團(tuán)的單細(xì)胞，獲得\3D細(xì)胞團(tuán)，在 DIC顯微鏡（微分干涉差顯微鏡）下，采集細(xì)胞圖像，結(jié)果如圖2所示，圖中，細(xì)胞在培養(yǎng)液 中聚集生長(zhǎng)，形成細(xì)胞團(tuán)塊狀結(jié)構(gòu)，這樣有助于細(xì)胞間緊密連接，促進(jìn)細(xì)胞間的信息交流， 從而減小培養(yǎng)環(huán)境與體內(nèi)環(huán)境的差異性，模擬體內(nèi)細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境。
[0048] 利用奧林巴斯的Cellsens Standard軟件測(cè)量不同培養(yǎng)天數(shù)下，細(xì)胞團(tuán)的直徑大 小，結(jié)果如圖3所示，圖中可看出，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞團(tuán)直徑開始逐漸增大，培養(yǎng)到 第7天時(shí)達(dá)到最大，平均為106. 09 μ m，隨后細(xì)胞團(tuán)直徑開始降低。
[0049] 2. 4、AL3D細(xì)胞團(tuán)計(jì)數(shù)