基于d-丙氨酸缺陷型篩選標(biāo)記的表達d-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶的重組枯草芽孢桿菌的構(gòu) ...的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明一種基于D-丙氨酸缺陷型篩選標(biāo)記的表達D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶的 重組枯草芽孢桿菌的構(gòu)建方法，涉及一種DPE酶在枯草芽孢桿菌中的食品級表達，屬于酶 基因工程技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶（DPE酶)屬于D-塔格糖3-差向異構(gòu)酶(簡稱DTE)家 族酶，可以催化多種酮糖C3位的差向異構(gòu)，是生產(chǎn)稀有糖的良好的生物催化劑，可單獨或 與其他酶偶聯(lián)合成多種碳水化合物，被廣泛的應(yīng)用于化學(xué)、食品和制藥等領(lǐng)域。目前，DPE酶 可催化D-果糖和D-阿洛酮糖之間的轉(zhuǎn)化，利用D-果糖生產(chǎn)D-阿洛酮糖。
[0003] 隨著由過量高能量食物攝入引發(fā)的一系列慢性病在世界范圍內(nèi)的爆發(fā)，膳食結(jié)構(gòu) 越來越受到人們的關(guān)注。新型的蔗糖替代品的開發(fā)和研宄仍是功能性甜味劑領(lǐng)域具有重要 的經(jīng)濟價值的當(dāng)務(wù)之急。D-阿洛酮糖是一種天然己酮糖，D-阿洛酮糖擁有蔗糖甜度的70%， 能量值卻只有蔗糖的〇. 3%，具有較高的溶解度，較低的血糖反應(yīng)。因此它是一種理想的甜味 劑，也是蔗糖的完美替代品。D-阿洛酮糖已于2011年被FDA認(rèn)定為GRAS食品。此外D-阿 洛酮糖還可以減少脂肪堆積和清除活性氧等生理作用，在制藥業(yè)中有很大的應(yīng)用前景。
[0004] 自然界中，D-阿洛酮糖的含量極少，近年來通過新技術(shù)開發(fā)可實現(xiàn)其大規(guī)模生產(chǎn)。 D-阿洛酮糖的生產(chǎn)方法有化學(xué)法和生物法?；瘜W(xué)合成法存在工藝復(fù)雜、副產(chǎn)物多、分離純化 困難、食品安全性等問題。而通過D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶（D-psicose 3-epimerase， DPEase，EC 5. I. 3. 30)把D-果糖差向異構(gòu)化為D-阿洛酮糖的生物轉(zhuǎn)化法因具有反應(yīng)簡 單、產(chǎn)物單一、純化步驟容易等優(yōu)點而逐漸吸引了眾多科學(xué)家的關(guān)注，也成為D-阿洛酮糖 商業(yè)化生產(chǎn)的熱點和焦點。
[0005] 枯草芽孢桿菌是芽孢桿菌的一個種，有長期制備發(fā)酵食品 的歷史，是非致病的，且不產(chǎn)生毒素和致熱致敏蛋白，被美國食品藥物管理局（FDA)和中國 農(nóng)業(yè)部等部門批準(zhǔn)為食品級安全菌株。表達系統(tǒng)沒有明顯的密碼子偏 好性，表達產(chǎn)物不容易形成包涵體，具有很強的蛋白分泌功能，有利于目的蛋白的回收和純 化等后續(xù)操作，并且遺傳背景研宄比較清楚，并具有多年的工業(yè)生產(chǎn)技術(shù)基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明目的是提供一株表達D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶的食品級安全的重組枯 草芽孢桿菌，并可用于轉(zhuǎn)化D-果糖生成D-阿洛酮糖。對D-阿洛酮糖的食品生產(chǎn)具有重要 的意義。
[0007] 本發(fā)明的技術(shù)方案：一種基于D-丙氨酸缺陷型篩選標(biāo)記的表達D-阿洛酮糖 3_差向異構(gòu)酶的重組枯草芽孢桿菌，其組成為lA751-pUB-P43-DPE-dal，分類命名為枯草 芽孢桿菌（AaciBw1S SK38. 001，已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號 CCTCC NO ：Μ 2015257ο
[0008] 所述基于D-丙氨酸缺陷型篩選標(biāo)記的表達D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶的重組 枯草芽孢桿菌的構(gòu)建方法，包括敲除枯草芽孢桿菌1Α751染色體上的D-丙氨酸消旋酶基 因 ?Λ得到宿主D-丙氨酸缺陷型的枯草芽孢桿菌1Α751 (?Γ);將來源于梭狀芽胞桿菌 (C/oWrii/i腫sciflifeas ) ATCC 35704的D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶DPE基因和Ρ43啟 動子構(gòu)建至質(zhì)粒PUBllO中得到pUB-P43-DPE ;用D-丙氨酸消旋酶基因 W代替抗性基因 卡那霉素 Kan和博來霉素 Blm作為篩選標(biāo)記的可復(fù)制質(zhì)粒pUB-P43-DPE-dal ;并轉(zhuǎn)化枯草 芽孢桿菌1A751 中表達，獲得一株基于D-丙氨酸缺陷型篩選標(biāo)記的表達D-阿洛 酮糖3-差向異構(gòu)酶的重組枯草芽孢桿菌lA751-pUB-P43-DPE-dal，命名為枯草芽孢桿菌 SK38. 001，即 CCTCC NO :M 2015257。
[0009] 具體步驟為： (1)在枯草芽孢桿菌1A751染色體上的D-丙氨酸消旋酶基因乃的上下游各選 取800-900bp長度的片段作為同源臂。通過PCR將兩段同源臂擴增，并膠回收。選取 抗性基因片段作為篩選標(biāo)記。將上下游同源臂和片 段通過融合PCR將三段基因連接在一起。將PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌1Α751感受態(tài) 中，在含有壯觀霉素（5/7C)的平板上篩選。由于同源臂的存在，發(fā)生同源重組，敲除枯草 芽孢桿菌1Α751染色體上的D-丙氨酸消旋酶基因乃，得到D-丙氨酸缺陷型的宿主 1Α751 -spc。
[0010] (2)將pTSC質(zhì)粒導(dǎo)入上述宿主lA751(W〇-spc中，在含有紅霉素的平板上篩選。 在IPTG的誘導(dǎo)下，表達重組酶Cre，在重組酶Cre的作用下，和位點發(fā)生重組， 將5/7C抗性基因刪除。并獲得一株D-丙氨酸缺陷型的枯草芽孢桿菌1Α751 ( WO。
[0011] (3)在DPE酶基因的上游通過PCR技術(shù)融合強啟動子Ρ43,并與DPE酶基因組成表 達單元P43-DPE，然后構(gòu)建至質(zhì)粒pUBl 10中，得到質(zhì)粒pUB-P43-DPE。
[0012] (4)敲除質(zhì)粒pUB-P43-DPE上的抗生素抗性基因 Kan和Blm，將D-丙氨酸消旋酶 基因（W)構(gòu)建至表達載體pUB-P43-DPE中，得到質(zhì)粒pUB- P43-DPE-dal。
[0013] (5)將重組質(zhì)粒pUB- P43-DPE-dal轉(zhuǎn)入宿主1A751 (?Γ)感受態(tài)中，在LB平板 上篩選，從而獲得重組枯草芽孢桿菌lA751-pUB-P43-DPE-dal，即枯草芽孢桿菌 SK38. 001。
[0014] 為增強表達，在DPE基因的上游添加 P43啟動子，P43啟動子的核苷酸序列如SEQ NO. 1中1-300位所示。
[0015] 質(zhì)粒pUB-P43-DPE-dal，其中含有所述SEQ ID NO. 1中301-1170位所示的DPE酶 基因和SEQ ID NO. 2所示的D-丙氨酸消旋酶基因 W，代替抗生素抗性基因卡那霉素 Kan 和博來霉素 Blm作為篩選標(biāo)記。
[0016] 所述的重組枯草芽孢桿菌lA751-pUB-P43-DPE-dal的應(yīng)用，可用于生產(chǎn)D-阿洛酮 糖，在化學(xué)、食品及制藥領(lǐng)域中的應(yīng)用。
[0017] 本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明提供一株表達D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶的重組枯草 芽孢桿菌 lA751-pUB-P43-DPE-dal，命名為枯草芽孢桿菌SK38. 001， 其可以D-果糖為底物生產(chǎn)D-阿洛酮糖。該重組菌在化學(xué)、食品和制藥領(lǐng)域中具有重要的 應(yīng)用價值。
[0018] 生物材料樣品保藏：一株枯草芽孢桿菌5·?Α??75·)3Κ38. 001，已保藏于 中國典型培養(yǎng)物保藏中心，簡稱CCTCC，地址：中國武漢武漢大學(xué)，保藏編號CCTCC NO : M 2015257,保藏日期2015年4月28日。
【附圖說明】
[0019] 圖I :D-丙氨酸缺陷型枯草芽孢桿菌1A751 WO的構(gòu)建過程。
[0020] 圖2 :食品級安全質(zhì)粒pUB- P43-DPE-dal構(gòu)圖。
[0021] 圖3 :重組菌SK38. 001的發(fā)酵及酶活曲線。
【具體實施方式】
[0022] 實施例1 :D_丙氨酸缺陷型的枯草芽孢桿菌1A751 WO的構(gòu)建
以質(zhì)粒P7S6為模板，引物對P3/P4將^?71-577^抗生素抗性基因片段擴增并回 收。在枯草芽孢桿菌1Α751染色體上的D-丙氨酸消旋酶基因兩側(cè)選擇800-900bp長 度的片段作為同源區(qū)域，將兩端的同源區(qū)域分別用引物對P1/P2及P5/P6擴增并回收。
[0023] 用引物對P1/P6將兩端同源臂片段與抗生素通過PCR技術(shù)融合 在一起。
[0024] PCR反應(yīng)體系：0. 2mL PCR管中按順序加入以下試劑：上下游引物各I. 5 yL ;5 UL Phusion HF buffer (5X) ;2 μ L IOmM dNTP mix (2. 5mM each) ;2yL 上游同源臂；0.5 yL 下游同源臂；0.5 yL Phusion high-fidelity DNA聚合酶；加蒸饋 水至終體積50 μ L。
[0025] PCR 擴增條件：98°C預(yù)變性 30s ;98°C變性 30s，55°C退火 15s，72°C延伸 Imin (30