互 作用的輸入鏈A-X-B。輸出包括廢產(chǎn)物（即完全堿基配對(duì)雙鏈體B' -X' -A' /A-X-B)和"輸 出1"鏈X-B-Y-C (可用作進(jìn)一步反應(yīng)的"輸入2"）。"輸入2"與"翻譯元件2"相互作用， 并產(chǎn)生"輸出2"和另一廢產(chǎn)物。在該圖中，X-B-Y-C的B區(qū)在翻譯元件1中通過雜交至互 補(bǔ)的B'區(qū)而被隔離，因而不能與翻譯元件2的B'區(qū)相互作用。X-B-Y-C與翻譯元件2的相 互作用能力取決于系統(tǒng)內(nèi)輸入I(A-X-B)的存在。
[0052] 雖然立足點(diǎn)幾何學(xué)可能非常有用，但是其用途到目前為止受到包含這種立足點(diǎn)幾 何學(xué)的系統(tǒng)能夠傳播信息的速度的限制。常規(guī)立足點(diǎn)隔離法中的固有限制常?？梢詫⑿纬?的傳播降低至生物學(xué)上有用的時(shí)間尺度以下。更具體地說，由于碰撞相互作用，立足點(diǎn)隔離 的翻譯元件僅在很窄的濃度動(dòng)態(tài)范圍內(nèi)以適宜的速度起作用。通常調(diào)整立足點(diǎn)的長(zhǎng)度，可 使碰撞相互作用在較低濃度時(shí)成為可逆的。但是，當(dāng)濃度增加時(shí)，碰撞將占主要部分，系統(tǒng) 將會(huì)慢慢停止。另一方面，當(dāng)濃度降低時(shí)，立足點(diǎn)介導(dǎo)的置換也將慢慢停止。在這個(gè)意義上， 要注意的是，在生物體內(nèi)，濃度變化很大，因而這樣的翻譯元件很難適用于試劑的生物體環(huán) 境。動(dòng)力學(xué)瓶頸被認(rèn)為是由非生產(chǎn)性反應(yīng)造成的，非生產(chǎn)性反應(yīng)在本文也稱作"立足點(diǎn)碰 撞"，其發(fā)生于立足點(diǎn)被不能產(chǎn)生置換反應(yīng)的具有互補(bǔ)序列或"碰撞鏈"的分子結(jié)合時(shí)。
[0053] 例如，圖3A顯示了具有三個(gè)立足點(diǎn)隔離的核酸翻譯元件的系統(tǒng)，其與圖2A中的系 統(tǒng)非常類似。但是，如果三個(gè)鏈都共同處于溶液中，可能發(fā)生其他結(jié)合事件。圖3B圖示了 可能發(fā)生的一些非生產(chǎn)性結(jié)合事件或碰撞。通過引入"多核苷酸碰撞分子"，這些事件不會(huì) 導(dǎo)致置換反應(yīng)，但可使系統(tǒng)減緩，因?yàn)榕鲎叉湹陌l(fā)生阻礙可產(chǎn)生置換反應(yīng)的鏈結(jié)合。當(dāng)核酸 翻譯元件的濃度在系統(tǒng)內(nèi)升高時(shí)，這種碰撞事件可變得更加占優(yōu)勢(shì)。
[0054] 這種方法的另一個(gè)限制在于由翻譯元件的大的單鏈區(qū)的暴露導(dǎo)致的潛在毒性。例 如，當(dāng)單鏈區(qū)結(jié)合至細(xì)胞的內(nèi)源性DNA或RNA時(shí)，它可改變?cè)揇NA或RNA分子的轉(zhuǎn)錄、翻譯 或其他功能。這種"非靶標(biāo)"事件可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的不期望的后果。
[0055] 還有一個(gè)限制在于潛在的信號(hào)泄漏，這是由翻譯元件在不存在暴露的立足點(diǎn)的情 況下的背景反應(yīng)導(dǎo)致的，這也可能導(dǎo)致不期望的后果。例如，圖4a顯示了翻譯元件和立足 點(diǎn)之間的反應(yīng)性隨著立足點(diǎn)濃度的升高而上升。但是，在不存在立足點(diǎn)的情況下，也觀察到 了背景反應(yīng)性（圖4b)。
[0056] -種建議的解決方案是保持立足點(diǎn)較短從而減輕碰撞對(duì)系統(tǒng)的影響：立足點(diǎn)越 短，互補(bǔ)序列的開關(guān)速度越快。因此，常見的是5個(gè)或6個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的立足點(diǎn)，因?yàn)樵谶@ 些長(zhǎng)度時(shí)，如果非生產(chǎn)性結(jié)合事件發(fā)生，雙鏈的"碰撞"狀態(tài)持續(xù)的時(shí)間則短。
[0057] 但是，該方法造成了前述的動(dòng)力學(xué)瓶頸，因?yàn)樯a(chǎn)性結(jié)合事件受到相同的熱動(dòng)力 學(xué)參數(shù)的限制；因此，加入的鏈同樣不會(huì)牢固地結(jié)合至這些立足點(diǎn)。因此，當(dāng)結(jié)合了正確的 加入鏈時(shí)，期望的置換并非總是出現(xiàn)，因?yàn)樗枰幱诮Y(jié)合狀態(tài)足夠長(zhǎng)的時(shí)間，以啟動(dòng)置換 反應(yīng)。因此，短立足點(diǎn)的使用增加了出現(xiàn)特定操作和產(chǎn)生輸出所需的時(shí)間量。換言之，在發(fā) 生許多結(jié)合事件（包括碰撞鏈結(jié)合和期望鏈結(jié)合）之前，置換反應(yīng)不會(huì)發(fā)生。這種低效率 限制了該系統(tǒng)的實(shí)用性，其將信息的傳播減慢到太長(zhǎng)而無(wú)不能利用的時(shí)間尺度。
[0058] 較短的立足點(diǎn)，聯(lián)合翻譯元件上的較短的單鏈區(qū)，也可幫助降低毒性。但是，較短 的立足點(diǎn)不能解決信號(hào)泄漏的問題。
[0059] 立足點(diǎn)交換
[0060] "立足點(diǎn)交換"使用于立足點(diǎn)隔離類似的配對(duì)相互作用，但使用不同的幾何學(xué)。立 足點(diǎn)交換嘗試解決由立足點(diǎn)隔離途徑造成的立足點(diǎn)碰撞問題。參考圖5,初始立足點(diǎn)A-B僅 與該立足點(diǎn)正下方的雙鏈體的單鏈區(qū)部分地互補(bǔ)（即A::Z )。類似地，當(dāng)B-C-D立足點(diǎn)通 過與A-B立足點(diǎn)的交換反應(yīng)而產(chǎn)生時(shí)，B-C-D立足點(diǎn)也僅與其下方的雙鏈體的單鏈區(qū)部分 地互補(bǔ)。這樣將不會(huì)發(fā)生立足點(diǎn)碰撞。
[0061] 但是，立足點(diǎn)交換法也具有固有限制。首先，與立足點(diǎn)隔離類似，翻譯元件的長(zhǎng)單 鏈區(qū)可導(dǎo)致不期望的毒性作用（由與細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)源性核酸非靶標(biāo)結(jié)合導(dǎo)致）。
[0062] 另一個(gè)問題涉及翻譯的動(dòng)態(tài)濃度，這與立足點(diǎn)碰撞中遇到的問題類似，但不相同。 但該問題對(duì)于立足點(diǎn)交換而言不太嚴(yán)重，因?yàn)橄啾扔诋a(chǎn)率，它對(duì)翻譯的速度影響更大。在這 種情況下，立足點(diǎn)的長(zhǎng)度決定了自發(fā)解離的速率，較短的立足點(diǎn)自發(fā)解離速度較快。另一方 面，長(zhǎng)度還決定了正向置換速率，但較長(zhǎng)的立足點(diǎn)使正向置換更快。因此，在這些限制因素 之間存在一個(gè)依賴于濃度的方式的平衡。
[0063] 立足點(diǎn)交換法的一個(gè)重要限制在于低產(chǎn)率，因?yàn)樗械姆磻?yīng)都是雙向的，導(dǎo)致對(duì) 終產(chǎn)物的無(wú)青睞性，除非例如整個(gè)翻譯最終被結(jié)合至不可逆反應(yīng)。
[0064] 旋轉(zhuǎn)隔離的翻譯元件
[0065] 本發(fā)明提供了一系列翻譯元件，其解決了以上詳細(xì)描述的各種方法帶來(lái)的問題。 利用這些翻譯元件，使得非靶標(biāo)的毒性作用和背景反應(yīng)性最小化，可避免立足點(diǎn)碰撞，整體 產(chǎn)率接近于完全，并且翻譯速度被顯著提高。
[0066] 圖6A圖示了"旋轉(zhuǎn)隔離翻譯元件"系統(tǒng)中的某些基本組件。在頂部的是形成在兩 個(gè)鏈A-X-C和D-X-5之間的核酸復(fù)合物（101)。借助它們的序列互補(bǔ)性，形成有雙鏈區(qū) X.:: Z ,而A、C、D和5仍為單鏈。這種部分雙鏈體下文被稱為"雙立足點(diǎn)"。
[0067] 圖6A中顯示的第二核酸復(fù)合物（102)由四個(gè)核酸鏈構(gòu)成：B-X-D、f-Z-：?、 d_F_￡*f-y-c。如圖所示，這些鏈在它們之間形成四個(gè)雙鏈區(qū)，在端部形成四個(gè)單鏈區(qū)。 這四個(gè)鏈中的一個(gè)，J-Z，與第一復(fù)合物中的其中一個(gè)鏈A-X-C互補(bǔ)，另一個(gè)鏈B-X-D 與第一復(fù)合物中的另一個(gè)鏈D-Y-互互補(bǔ)。
[0068] 借助于突出的單鏈區(qū)的序列互補(bǔ)性，第一復(fù)合物（101)具有適當(dāng)?shù)男蛄谢パa(bǔ)性， 從而能夠結(jié)合第二復(fù)合物（102)，這啟動(dòng)了涉及6個(gè)鏈的鏈置換反應(yīng)。鏈置換反應(yīng)的輸出包 括兩個(gè)完全退火的雙鏈體（105和106)以及一個(gè)新的雙立足點(diǎn)（107)，該新的雙立足點(diǎn)具有 在中部的雙鏈區(qū)以及四個(gè)獨(dú)立的單鏈區(qū)（圖6B)。
[0069] 圖6B顯示輸出核酸復(fù)合物（105、106和107)處于較低能量狀態(tài)，因?yàn)榇嬖趦蓚€(gè)完 全的雙鏈體A-X-C::〔-H (105)和(106)。換言之，這種鏈置換強(qiáng)烈 地傾向于正向方向，因此不容易逆轉(zhuǎn)。
[0070] 新形成的雙立足點(diǎn)，由D-F-F和F-Y-C構(gòu)成（107)，隨后可啟動(dòng)與圖6A中的第三 核酸復(fù)合物（103)的另一個(gè)鏈置換反應(yīng)（箭頭所示），從而繼續(xù)翻譯程序。類似地，從該置 換反應(yīng)生成的新的雙立足點(diǎn)可靶定第四復(fù)合物（104)，依此類推。
[0071] 如以上所解釋的，這種方式的鏈置換反應(yīng)達(dá)到了高的產(chǎn)出速度，因?yàn)槊總€(gè)反應(yīng)以 比輸入核酸分子低得多的能量狀態(tài)產(chǎn)生輸出產(chǎn)物。而且，如表1所示，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示這種雙 立足點(diǎn)介導(dǎo)的反應(yīng)也可以很快。將"雙立足點(diǎn)"欄與"3'立足點(diǎn)"或"5'立足點(diǎn)"中的那些 進(jìn)行比較。
[0072] 表1.單立足點(diǎn)和雙立足點(diǎn)介導(dǎo)的鏈置換反應(yīng)的反應(yīng)速度比較
[0074] 根據(jù)這些發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供大量的翻譯元件和翻譯元件群組（有時(shí)也稱作"適配 元件"）。翻譯元件或翻譯元件群組利用一個(gè)核酸分子（例如單鏈核酸、完全或部分雙鏈核 酸、或更復(fù)雜的核酸結(jié)構(gòu)或翻譯元件）作為輸入，并進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)鏈置換反應(yīng)，以產(chǎn)生一 個(gè)或多個(gè)核酸分子作為輸出。每個(gè)輸入或輸出可作為系統(tǒng)內(nèi)其他翻譯元件或翻譯元件群組 的輸出或輸入。因此，每個(gè)翻譯元件和翻譯元件群組起到一個(gè)邏輯算子的作用，它們組合起 來(lái)執(zhí)行期望的計(jì)算和信息傳送。
[0075] 因此，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式提供一種組合物，其包含第一核酸復(fù)合物和第二核 酸復(fù)合物，每個(gè)均包含第一、第二、第三和第四核酸鏈。每個(gè)鏈按順序（即從5'至3'，連 續(xù)地或用中間核苷酸隔開）第一片段、第二片段和第三片段，其中對(duì)于第一復(fù)合物的第 一、第二、第三和第四鏈，核酸鏈分別被定義為：B-X_D、5-X-Z、〇-7-1和？-￥_(：，對(duì)于 第二復(fù)合物的第一、第二、第三和第四鏈，核酸鏈分別被定義為：t-F-F、E-Y-D、F-Z-G、 F-Z-亙。每個(gè)字母表示一個(gè)片段，以連接的每個(gè)字母串表示一個(gè)鏈。
[0076] 在一個(gè)方面，第一復(fù)合物和第二復(fù)合物的每一個(gè)包含形成于第一鏈的第二片段 和第二鏈的第二片段之間的第一雙鏈區(qū)（在第一復(fù)合物和第二復(fù)合物中分別為X::尤和 F::Y )、形成于第三鏈的第二片段和第四鏈的第二片段之間的第二雙鏈區(qū)（Y::F和Z::Z )、形成于第一鏈的第三片段和第三鏈的第一片段之間的第三雙鏈區(qū)（D::D和P::F )、以 及形成于第二鏈的第一片段和第四鏈的第三片段之間的第四雙鏈區(qū)（C::C和E::f )。
[0077] 在第一復(fù)合物和第二復(fù)合物的每一個(gè)中，第一鏈的第一片段（在第一復(fù)合物和第 二復(fù)合物中分別為B和C )、第二鏈的第三片段（I和D)、第三鏈的第三片段（亙和G)和 第四鏈的第一片段（F和F )都是單鏈的。
[0078] 而且，第一復(fù)合物的第三鏈（D-F-亙）具有與第二復(fù)合物的第二鏈（E-Y-D)合適 的序列互補(bǔ)性，從而允許它們?cè)陔s交條件下結(jié)合；并且第一復(fù)合物的第四鏈（F-Y-C)具有 與第二復(fù)合物的第一鏈（G-F-F )合適的序列互補(bǔ)性，從而允許它們?cè)陔s交條件下結(jié)合。
[0079] 在一個(gè)方面，所述組合物進(jìn)一步包含第三核酸復(fù)合物，其包含第一核酸鏈和第 二核酸鏈，每個(gè)鏈按順序包含第一、第二和第三片段，其中第一鏈和第二鏈分別被定義為 E-Z-H和G-Z-F，其中第三核酸復(fù)合物包含形成于第一鏈的第二片段和第二鏈的第二片 段之間的雙鏈區(qū)(Z::Z)，并且第一鏈的第一片段（E)和第二鏈的第三片段（F)是單鏈的， 并且其中：第二復(fù)合物的第三鏈（F-Z-G)具有與第三復(fù)合物的第二鏈（G-Z-戸）合適的 序列互補(bǔ)性，從而允許它們?cè)陔s交條件下結(jié)合；并且第二復(fù)合物的第四鏈（/7 -Z-Z )具有 與第三復(fù)合物的第一鏈（E-Z-H)合適的序列互補(bǔ)性，從而允許它們?cè)陔s交條件下結(jié)合。
[0080] 化學(xué)修飾以避免立足點(diǎn)碰撞
[0081] 本發(fā)明還提供了防止立足點(diǎn)碰撞的方法。如圖6A所示，由于暴露出的單鏈區(qū)C/萬(wàn) 和P/D，立足點(diǎn)碰撞仍可發(fā)生于例如立足點(diǎn)（101)和復(fù)合物（103)之間。
[0082] 在一個(gè)這樣的方法中，每個(gè)可能在翻譯過程中以單鏈被暴露出來(lái)的核酸片段都經(jīng) 受潛在的化學(xué)修飾。除了其自然狀態(tài)（狀態(tài)N，在例如Cn中以下標(biāo)表示），每個(gè)這樣的片段 都可被修飾而形成兩種狀態(tài)，分別為狀態(tài)R(例如右旋）和狀態(tài)L (左旋），只要這樣的修飾 允許（或促進(jìn)）和阻止（或抑制）特定狀態(tài)的互補(bǔ)鏈之間的結(jié)合，如下表2所示。
[0083] 表2.化學(xué)修飾的結(jié)合目的
[0085] 通過這樣的修飾，在一個(gè)方面，第一復(fù)合物102的第三鏈的尾部片段（^ )具有與 第三復(fù)合物（104)的第一鏈的第一片段的頭部片段（Ek)相反的序列互補(bǔ)性，但不會(huì)穩(wěn)定地 與其結(jié)合。同樣，在另一個(gè)方面，第一復(fù)合物（102)的第四鏈的頭部片段（匕）具有與第三 復(fù)合物（104)的第一鏈的第一片段的尾部片段（巧）相反的序列互補(bǔ)性，但不會(huì)穩(wěn)定地與 其結(jié)合。因此，不會(huì)發(fā)生立足點(diǎn)碰撞，并且這些修飾保證了置換反應(yīng)以受控的方式進(jìn)行。因 此，在一個(gè)方面，術(shù)語(yǔ)"旋轉(zhuǎn)"是指調(diào)節(jié)隔離的修飾（L和R)，而非所使用的交換反應(yīng)。
[0086] 如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)"不會(huì)穩(wěn)定地與其結(jié)合"表示兩個(gè)核酸鏈不會(huì)形成穩(wěn)定的雙 鏈體結(jié)構(gòu)，即使它們共享序列互補(bǔ)性。在一些方面，"穩(wěn)定的"雙鏈體結(jié)構(gòu)是指能夠以非瞬 時(shí)的形式存在的雙鏈體并且在反應(yīng)溶液中的濃度高于每個(gè)單獨(dú)的鏈的總濃度的〇. 1 %、或 1%、或 5%、或 10%。
[0087] 如下文進(jìn)一步描述的，能夠?qū)崿F(xiàn)表2中定義的結(jié)合目的的化學(xué)修飾是已知的。"化 學(xué)修飾"在本文中并不限于在核酸分子產(chǎn)生后對(duì)其進(jìn)行化學(xué)性的修飾；該術(shù)語(yǔ)還包括在產(chǎn) 生該核酸分子期間引入經(jīng)化學(xué)修飾的核苷酸。
[0088] 有許多已充分研宄的核酸修飾可被用來(lái)調(diào)節(jié)與天然DNA或RNA結(jié)合的熱動(dòng)力學(xué)性 質(zhì)。它們包括對(duì)寡核苷酸的骨架、糖或核堿基的改變。這些修飾可單獨(dú)使用或彼此結(jié)合使 用；即，使用經(jīng)修飾的骨架并不排除在相同的鏈中使用經(jīng)修飾的核堿基。
[0089] 核酸骨架類似物可被用來(lái)改善能夠產(chǎn)生置換反應(yīng)的鏈的結(jié)合。有許多不同的類似 物可供使用，所有這些都提供比天然核酸更加緊密的對(duì)DNA和RNA的結(jié)合親和性。這些類 似物包括但不限于具有不帶電的骨架（肽核酸或二酰胺基磷酸酯）、帶正電的骨架（胍基 肽核酸）、允許預(yù)組構(gòu)（pre-organization)的氫結(jié)合基團(tuán)（γ肽核酸）的核酸。在一個(gè)方 面，骨架包括結(jié)合了 mini-PEG的絲氨酸衍生的γ-ΡΝΑ，如圖7f-g所示。
[0090] 某些類似物的大體結(jié)構(gòu)見圖7。這些類似物都提高核酸雜交反應(yīng)的熱動(dòng)力學(xué)，允 許更緊密的立足點(diǎn)結(jié)合，因而允許更快的置換。通過在邏輯網(wǎng)絡(luò)的特定位置使用這些類似 物，與碰撞相互作用相比，可強(qiáng)有力地朝期望的置換反應(yīng)方向進(jìn)行，因而加快期望的鏈置換 反應(yīng)的速率。
[0091] 使用經(jīng)修飾的糖環(huán)也可改變寡核苷酸結(jié)合DNA或RNA的熱動(dòng)力學(xué)。使用最廣泛的 類似物是嗎啉代、鎖核酸（LNA)和LNA衍生物。其他經(jīng)修飾的糖在文獻(xiàn)中被證明在改變結(jié) 合熱動(dòng)力學(xué)方面也可以產(chǎn)生類似效果。它們的例子為在1'、2'、3'或4'位具有修飾的糖以 及核糖環(huán)戊烷環(huán)中的氧被不同原子取代的糖。這些類似物圖示于圖8中。
[0092] 核堿基修飾也可用來(lái)實(shí)現(xiàn)與骨架和糖類似物相同的作用；即，改變特定雜交反應(yīng) 的熱動(dòng)力學(xué)。這些堿基包括甲基胞嘧啶、二氨基蝶呤、G形夾和吩惡嗪（圖9)，它們均提高 鏈對(duì)其反向互補(bǔ)序列的結(jié)合親和性。核堿基修飾存在的另一個(gè)機(jī)會(huì)涉及偽互補(bǔ)堿基。這類 堿基類似物彼此形成弱堿基對(duì)，但與標(biāo)準(zhǔn)堿基形成強(qiáng)堿基對(duì)。一個(gè)這樣的堿基對(duì)是2-氨基 腺嘌呤（nA)和2-硫代胸腺嘧啶（sT)。這些堿基可用于有利于一條鏈結(jié)合同時(shí)不利于另一 條鏈結(jié)合，這是提高生產(chǎn)性結(jié)合事件幾率同時(shí)降低碰撞幾率的一個(gè)例子。
[0093] 可用于改變結(jié)合相互作用的熱動(dòng)力學(xué)的另一種化學(xué)修飾是引入荷電聚合物，如殼 聚糖，其已在文獻(xiàn)中被顯示促進(jìn)置換反應(yīng)的速率。但是，因?yàn)檫@些聚合物非特異性地加速反 應(yīng)，所以它們必須結(jié)合上述其他修飾中的一種來(lái)應(yīng)用，以能夠區(qū)別期望的和不期望的結(jié)合 事件。
[0094] 可使用不同的方法來(lái)合成具有上述化學(xué)修飾的分子。例如，設(shè)計(jì)經(jīng)修飾的分 子時(shí)可以考慮骨架化學(xué)。骨架化學(xué)用于將單