一種黃瓜綠斑駁花葉病毒侵染性克隆重組載體、黃化突變體及其構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明涉及一種黃瓜綠斑駁花葉病毒侵染性克隆重組載體、黃化突變體及其構(gòu)建方法，屬于基因工程領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0003]本發(fā)明提供了一種黃瓜綠斑駁花葉病毒侵染性克隆重組載體、黃化突變體及其構(gòu)建方法，不但構(gòu)建了黃瓜綠斑駁花葉病毒的侵染性克隆載體，而且獲得了一株可使寄主產(chǎn)生黃化癥狀的突變體，為揭示黃瓜綠斑駁花葉病毒各基因的功能及癥狀的產(chǎn)生機制奠定基礎(chǔ)，解決了上述問題。
[0004]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為:
一種黃瓜綠斑駁花葉病毒侵染性克隆重組載體，其保存號為CGMCC N0.11281，于2015年10月9日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心進行保藏。
[0005]本發(fā)明也提供了一種黃瓜綠斑駁花葉病毒侵染性克隆重組載體的構(gòu)建方法，包括以下步驟:
(1)從感染黃瓜綠斑駁花葉病毒的黃瓜葉片中提純病毒粒子后再提取病毒RNA;
(2)設(shè)計兩對黃瓜綠斑駁花葉病毒的引物，
IF:5 ; -TGGGCAGAGAAAGGTAAGGCTGTCTT-3 '，如 SQE ID N0.1 所示；
1R:5 ' -TGGGCCCCTACCCGGGGAA-3 '，如 SQE ID N0.2 所示；
2F:5 ' -GTTTTAATTTTTATAATTAAACAAAC-3 '，如 SQE ID N0.3 所示；
2R:5 ' -GGCTCTCCGCCTAATCATAGCAGC-3 '，如 SQE ID N0.4 所示；
(3)以2R為引物，將提取植物總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA；
(4)以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，以1F/1R為引物進行PCR擴增，獲得4341bp片段，將其用Sail單酶切后插入到經(jīng)Smal和Sail雙酶切的pXTl載體中，得到重組載體pXTl_CG_B ；
以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，以2F/2R為引物，PCR擴增獲得2758bp片段，將其用Sail單酶切后插入到經(jīng)StuI和Sail雙酶切的pXTl-CG-B載體中，獲得ρΧΤΙ-CGMMV重組載體；
(5)將帶有黃瓜綠斑駁花葉病毒全長序列的重組載體pXTl-CGMMV導(dǎo)入農(nóng)桿菌菌株GV3101，構(gòu)建得到黃瓜綠斑駁花葉病毒侵染性克隆重組載體。
[0006]進一步本發(fā)明的一種優(yōu)選方案為:所述的重組載體pXTl-CG導(dǎo)入農(nóng)桿菌菌株GV3101采用的是液氮凍融法.本發(fā)明的另外一個目的:本發(fā)明提供了一種黃瓜綠斑駁花葉病毒黃化突變體，該突變體是黃瓜綠斑駁花葉病毒侵染性克隆重組載體中CP所編碼的第25位氨基酸亮氨酸突變成丙氨酸而成，其保存號為CGMCC N0.11282，于2015年10月9日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心進行保藏。
[0007]本發(fā)明的黃瓜綠斑駁花葉病毒黃化突變體的構(gòu)建方法，包括如下步驟:(1)從含有黃瓜綠斑駁花葉病毒侵染性克隆重組載體的大腸桿菌中提取質(zhì)粒； (2)設(shè)計含有突變位點的引物:
mutat1n-X:5 ' -GCtaattttctagttgcttcacaaggtacc-3 '，如 SQE ID N0.5 所不；mutat1n-S:5 ' -gaagcaactagaaaattaGCtaaagtcctga-3 '，如 SQE ID N0.6 所不
(3)利用PCR方法獲得含有突變位點的產(chǎn)物，并將其轉(zhuǎn)入大腸桿菌，經(jīng)測序篩選得到重組載體 PCGMMV-CP-L25A ；
(4)將重組載體pCGMMV-CP-L25A導(dǎo)入農(nóng)桿菌菌株GV3101，獲得黃化突變體載體。
[0008]進一步，本發(fā)明的一種優(yōu)選方案:所述的重組載體pCGMMV-CP-L25A導(dǎo)入農(nóng)桿菌菌株GV3101采用的是液氮凍融法。
[0009]本發(fā)明的有益效果:
(1)本發(fā)明的侵染性克隆重組載體使用農(nóng)桿菌接種，可根據(jù)接種要求靈活調(diào)整菌的培養(yǎng)量，較體外轉(zhuǎn)錄成本低、操作簡單；
(2)本發(fā)明的侵染性克隆重組載體使用2X35S增強型啟動子、強感染力農(nóng)桿菌菌株GV3101，大大提高了其侵染能力；
(3)本發(fā)明的黃瓜綠斑駁花葉病毒黃化突變體使寄主穩(wěn)定產(chǎn)生黃化癥狀，可用于該病毒癥狀產(chǎn)生機制的研究；
(4)本發(fā)明使用的方法可對構(gòu)建的載體進行其它缺失、插入、突變等操作，獲得一系列不同類型的突變體，用于開展病毒與寄主間不同互作模式方面的研究。
【附圖說明】
[0010]圖1為實施例中接種黃瓜綠斑駁花葉病毒侵染性克隆4周后不同寄主發(fā)病癥狀。
[0011]圖2為實施例中西瓜接種突變體后產(chǎn)生的黃化、壞死癥狀。
[0012]圖3為實施例中不同寄主接種黃瓜綠斑駁花葉病毒侵染性載體4周后DAS-ELISA檢測結(jié)果。
[0013]圖4為實施例中生煙接種突變體4周后DAS-ELISA檢測結(jié)果。
[0014]圖5為實施例中瓜接種突變體4周后DAS-ELISA檢測結(jié)果。
【具體實施方式】
[0015]下面將結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。
[0016]一種黃瓜綠斑駁花葉病毒侵染性克隆重組載體，其保存號為CGMCC N0.11281，于2015年10月9日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心進行保藏。
[0017]—種黃瓜綠斑駁花葉病毒黃化突變體，該突變體是黃瓜綠斑駁花葉病毒侵染性克隆重組載體中CP所編碼的第25位氨基酸亮氨酸突變成丙氨酸而成，其保存號為CGMCC N0.11282，于2015年10月9日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心進行保藏。
[0018]—種黃瓜綠斑駁花葉病毒侵染性克隆重組載體及其黃化突變體的構(gòu)建方法，包括以下步驟:
(1)病毒粒子的提純及其病毒RNA的提取取500 g感染黃瓜綠斑駁花葉病毒的黃瓜葉片，加入4倍體積預(yù)冷的0.1 Μ的磷酸緩沖液(ΡΗ7.2，含1%巰基乙醇)緩沖液，用粉碎機把葉片攪碎；把攪碎的混合液用四層紗布過濾，濾液每100 ml加入8 ml正丁醇，磁力攪拌20 min,Beckman JA-14轉(zhuǎn)頭，7205 g，低速離心30 min ;取上清，加入MW6000的PEG (每100 ml的上清加入4 g PEG)，4°C，磁力攪拌過夜，使溶液溶解完全；室溫靜置90 1^11后，弘-20轉(zhuǎn)頭，10，916 g，離心20 min，去上清，沉淀用0.1 Μ磷酸緩沖液(ρΗ7.2)充分懸?。晦D(zhuǎn)頭JA-20，7，076 g離心30 min,棄沉淀，取上清，上清液中加入NaCl至0.4%、PEG (MW6000)至0.4%，一邊加一邊攪拌，靜置60 min后，JA-20的轉(zhuǎn)頭，10，916 g離心15 min ;沉淀用0.1 Μ磷酸緩沖液(ρΗ7.2)充分懸浮，JA-20轉(zhuǎn)頭，7076 g離心15 min ;取上清，TyPE_45Ti轉(zhuǎn)頭，95，834 g，離心90 min，沉淀用0.1 Μ磷酸緩沖液(ΡΗ7.2)充分懸浮；過10%~40%蔗糖不連續(xù)梯度，Sff-40Ti轉(zhuǎn)頭，78925 g，離心90min ;吸20%蔗糖濃度梯度中乳白色的病毒帶，用0.01 Μ的PBS(pH7.2)稀釋，Type-90Ti轉(zhuǎn)頭，99，187 g離心90 min;用2ml 0.01 Μ磷酸緩沖液(ρΗ7.2)懸浮沉淀，即為提純的CGMMV病毒粒子。
[0019]取100 μ 1病毒粒子，加入500 μ? RNAiso Plus裂解液(TAKARA)，將其渦旋混勻，室溫靜置至分層；加入200 μ 1氯仿，劇烈振蕩混勻，室溫靜置5 min，4°C、12，000 g、離心15 min ;小心吸取上清液至新的2ml離心管中，加入等體積的異丙醇，上下輕輕顛倒混勻，室溫靜置10 min，4°C、12，000 g、離心10 min;棄上清，加入1 ml 75%乙醇，將RNA沉淀懸浮，4°C、12，000 g、離心5 min ;棄上清，瞭干乙醇，加入40 μ L RNase free dH20溶解RNA，既得病毒RNA。
[0020](2)設(shè)計兩對黃瓜綠斑駁花葉病毒的引物，
IF:5 ; -TGGGCAGAGAAAGGTAAGGCTGTCTT-3 '；
1R:5 ; -TGGGCCCCTACCCGGGGAA-3 '；
2F:5 ; -GTTTTAATTTTTATAATTAAACAAAC-3 '；
2R:5 ; -GGCTCTCCGCCTAATCATAGCAGC-3 '；
(3)以2R為引物，將提取植物總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA
以 2R 為引物，利用 M-MLV Reverse Transcriptase (TAKARA)將步驟 1 中的病毒 RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，具體如下:先加 1 μ? lOmM dNTP，1 μ? lOmM 2R，2 μ 1 RNA，混勻，于70°C水浴10 min，冰上預(yù)冷2 min，往體系中再依次添加2 μ 1 5 XM-MLV RTase Buffer、1 μ 1M-MLV Reverse Trans