一種銅藻多糖酶解物及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及海藻多糖提取物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種銅藻多糖酶解物及其在制備 調(diào)節(jié)腸道菌群失調(diào)的食品或藥物中的應(yīng)用。 (二）
【背景技術(shù)】
[0002] 腸道健康是近年來備受矚目的諸多健康問題之一，由于環(huán)境污染、抗生素在食物 鏈中的沉積、居民膳食結(jié)構(gòu)的變化以及人們健康需求的提高，對健康關(guān)注度的持續(xù)增長，人 們對健康的理解已經(jīng)開始由"表"及"里"，更加關(guān)注健康的本源一體內(nèi)微生態(tài)環(huán)境。益生元 在增加腸道內(nèi)源性益生菌的數(shù)量、調(diào)節(jié)腸道菌群組成等方面有著很大優(yōu)勢。多糖作為代表 性的益生元，具有來源廣泛、性質(zhì)穩(wěn)定、代謝產(chǎn)物無毒無害等優(yōu)點，是一種天然的功能性食 品成分。
[0003] 海藻是海洋生物資源的重要組成部分。銅藻又稱柱囊馬尾藻、草茜、竹茜菜，隸屬 于馬尾藻屬，是北太平洋西部特有的暖溫帶性海藻，不連續(xù)分布在我國沿海，是提取褐藻膠 的重要原料。銅藻多糖具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力、抗菌、抗病毒和抑制腫瘤細(xì)胞等生理活性，但 目前主要應(yīng)用于飼料和有機(jī)肥料方面，產(chǎn)品附加值低，造成資源的嚴(yán)重浪費(fèi)。目前，關(guān)于海 藻多糖研宄主要集中于羊棲菜、巖藻、海帶多糖等分離純化、藥理活性等方面。
[0004] 目前市場上常見的具有改善胃腸道功能的保健食品或藥品很多。中國專利公開號 CN102172270A，公開了一種調(diào)理保健胃腸的多糖沖劑及其制備方法，由猴頭菇多糖粉、山楂 粉、菊粉、低聚果糖粉、低聚木糖粉復(fù)合配比而成。利用微生物發(fā)酵技術(shù)獲得猴頭菇多糖比 分離純化提取猴頭菇多糖效率高，更經(jīng)濟(jì)，但是其純度和調(diào)理效果較后者差。中國專利公開 號CN102018216A，公開了一種調(diào)節(jié)腸道菌群和增強(qiáng)免疫力的含雙歧桿菌的組合物，所述組 合物由經(jīng)高密度培養(yǎng)和雙層包埋的雙歧桿菌、低聚糖、維生素、金屬元素和輔料混合配制而 成。雖然雙歧桿菌經(jīng)過雙層包埋技術(shù)和高密度培養(yǎng)，生產(chǎn)速率提高，較一般包埋技術(shù)到達(dá)腸 道后外層膠體更易溶解，但生產(chǎn)成本高，工藝繁瑣。
[0005] 銅藻俗稱"丁香屋"（中國南麂島），隸屬于馬尾藻屬。銅藻是北太平洋西部特有的 暖溫帶性海藻，是提取褐藻膠的重要原料，因富含有益的生源要素而被廣泛應(yīng)用到醫(yī)藥、食 品、飼料和有機(jī)肥料方面。研宄表明，銅藻藻體含褐藻酸、褐藻淀粉、甘露醇及多種氨基酸、 多糖、蛋白質(zhì)、維生素等。銅藻具有消痰軟堅、清熱利水的功效。近年來，銅藻多糖的開發(fā)和 用途已經(jīng)成為一個研宄的新課題，但目前對于銅藻多糖的研宄主要集中在其保濕保潤作用 以及抗氧化活性，例如本申請發(fā)明人之前發(fā)表的文章[徑向流耦合超濾分離純化銅藻多糖 及其煙絲保潤的應(yīng)用，食品與發(fā)酵工業(yè)，2012年08期，第197-202頁]、[銅藻多糖微波 輔提工藝優(yōu)化及其抗氧化活性研宄，核農(nóng)學(xué)報，，2014年06期，第1062-1069頁]以及專利 申請CN2015100921966均是關(guān)于銅藻多糖的抗氧化活性或者保濕保潤性能，我們的實驗表 明，根據(jù)這些文獻(xiàn)制備得到的銅藻多糖或者銅藻多糖的酶修飾物對于胃腸道功能的改善不 起作用。 (三）
【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種銅藻多糖酶解物及其在制備調(diào)節(jié)腸道菌群失調(diào)的食品 或藥物中的應(yīng)用，所述的銅藻多糖酶解物通過控制其分子量和雜質(zhì)含量，使得對于有益菌 具有顯著的增值作用，降低腸道PH，從而能夠改變腸道菌群結(jié)構(gòu)。
[0007] 為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：
[0008] 一種銅藻多糖酶解物，其通過如下方法制備：
[0009] (1)酶解預(yù)處理：取銅藻粉末與水混合，調(diào)節(jié)PH為5. 5,加入復(fù)合酶，所述復(fù)合酶為 木瓜蛋白酶與纖維素酶按照質(zhì)量比1 :1的混合，然后于50°c攪拌60~80min，離心取上清 液，即得酶解預(yù)處理液；
[0010] (2)醇沉：取酶解預(yù)處理液，加入乙醇溶液使得最終乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%并在該 條件下進(jìn)行沉淀操作，冷凍離心得到沉淀，加入蒸餾水使沉淀溶解，再經(jīng)蒸發(fā)溶劑、冷凍干 燥得到銅藻粗多糖SHP組分；
[0011] (3)徑向流脫色脫蛋白：使用裝填有弱堿性陽離子交換樹脂的徑向流色譜柱對銅 藻粗多糖SHP組分進(jìn)行脫色脫蛋白操作，其中洗脫劑為純水，得到SHPA多糖；
[0012] (4) SHPA酶解及純化：在pH 4. 5~5. 5的HAc-NaAc緩沖液體系中，SHPA多糖和葡 聚糖酶于50°C進(jìn)行酶解反應(yīng)2~3h，終止反應(yīng)后酶解反應(yīng)液采用孔徑大小為500Da規(guī)格的 透析袋進(jìn)行流水透析，透析液經(jīng)濃縮、冷凍干燥得到酶解產(chǎn)物；
[0013] (5)離子柱層析：酶解產(chǎn)物配成水溶液用0.45μπι微濾膜過濾，所得濾液用 DEAE-Sepharose Fast Flow離子柱層析系統(tǒng)進(jìn)行離子柱層析，分別以蒸餾水、0.1~ 0. 4mol/L NaCl水溶液進(jìn)行洗脫，選定最大洗脫峰對應(yīng)的洗脫液，濃縮、用0. 45 μ m微濾膜 過濾得到濾液；
[0014] (6)凝膠柱層析：步驟（5)所得濾液用Sephadex G-25凝膠層析系統(tǒng)進(jìn)行凝膠柱 層析，以蒸餾水進(jìn)行洗脫，以硝酸銀指示劑檢測洗脫液中是否脫鹽完全并收集不含鹽的多 糖部分，濃縮，冷凍干燥得到銅藻多糖酶解物。
[0015] 進(jìn)一步，步驟（1)中，銅藻粉末、水、復(fù)合酶的投料質(zhì)量比為I :14. 5~15. 5 : 0· 4%~0· 6%，優(yōu)選為 1:15:0. 5%。
[0016] 進(jìn)一步，步驟（3)中，所述弱堿性陰離子交換樹脂為A103S、A105或A100,優(yōu)選 A103S。所述的徑向流脫色脫蛋白可按照文獻(xiàn)（例如[銅藻多糖微波輔提工藝優(yōu)化及其抗 氧化活性研宄，核農(nóng)學(xué)報，2014年06期，第1062-1069頁])報道的方法進(jìn)行操作，得到洗脫 液，洗脫液經(jīng)濃縮、冷凍干燥即得到SHPA多糖。
[0017] 進(jìn)一步，步驟（4)中，SHPA多糖與葡聚糖酶的投料質(zhì)量比為I :0.5~2,優(yōu)選為 1:1~2,更優(yōu)選1:1 ;所述葡聚糖酶在所述緩沖液體系中的質(zhì)量濃度為0. 3-0. 4%。
[0018] 進(jìn)一步，步驟⑷中，酶解時間優(yōu)選為3小時。
[0019] 進(jìn)一步，步驟（5)中，離子柱層析中，上樣流速優(yōu)選為1~2mL/min，洗脫流速優(yōu)選 為 2 ~4mL/min〇
[0020] 進(jìn)一步，步驟（6)中，凝膠柱層析中，上樣流速為1~3mL/min，洗脫流速為2~ 4mL/min〇
[0021] 本發(fā)明中，冷凍離心在轉(zhuǎn)速8000~lOOOOrpm、溫度4~15°C條件下進(jìn)行，離心時 間優(yōu)選5~15min〇
[0022] 本發(fā)明中，木瓜蛋白酶、纖維素酶、葡聚糖酶均使用市售商品。
[0023] 本發(fā)明還提供了所述銅藻多糖酶解物在制備調(diào)節(jié)腸道菌群失調(diào)的食品或藥物中 的應(yīng)用。
[0024] 本發(fā)明的有益效果在于：
[0025] (1)本發(fā)明采用復(fù)合酶解法提取銅藻多糖，一方面通過降解細(xì)胞壁使多糖更易提 取從而提高得率；另一方面可以針對其中的大多數(shù)雜質(zhì)（纖維素、蛋白質(zhì)等）選擇性降解， 以更利于后續(xù)分離純化的進(jìn)行；同傳統(tǒng)水提法、微波和單一酶解法等相比，能夠提高多糖得 率，有效控制雜質(zhì)含量，同時提取工藝條件溫和，節(jié)能降耗。
[0026] (2)本發(fā)明制得的銅藻多糖酶解物對于有益菌具有顯著的增值作用，證明其能夠 改變腸道菌群結(jié)構(gòu)，降低腸道PH，可用于制備調(diào)節(jié)胃腸道菌群失調(diào)的食品或藥物。 (四）
【附圖說明】
[0027] 圖1是發(fā)酵過程pH的變化；
[0028] 圖2是益生元指數(shù)變化。 (五）
【具體實施方式】
[0029] 下面以具體實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步說明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限 于此：
[0030] 實施例1
[0031] (1)酶解預(yù)處理：
[0032] 將銅藻洗凈，控水，置于烘箱內(nèi)60°C烘干，粉碎。揀選破碎后過100目篩網(wǎng)的銅藻， 取100.0 g粉末，加入1500g的水中，調(diào)節(jié)pH為5. 5,加入0. 5g復(fù)合酶，復(fù)合酶為木瓜蛋白酶 (上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司，100萬U/g)與纖維素酶（張家港金源生物化工有限公司，8 萬u/g)質(zhì)量比1 :1的混合，放置于50°C恒溫水浴鍋，進(jìn)行勾速攪拌60min，4000rpm離心10 分鐘，取上清液即得酶解預(yù)處理液；
[0033] ⑵醇沉：
[0034] 取酶解預(yù)處理液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至1L，加入95%乙醇溶液至最終乙醇體積分?jǐn)?shù)為 60 %，靜置過夜。樣液冷凍離心10min (轉(zhuǎn)速lOOOOrpm，溫度4°C )，取沉淀，加入少量蒸餾水 將沉淀完全溶解，減壓蒸發(fā)并將殘留酒精完全蒸發(fā)，經(jīng)冷凍干燥得銅藻粗多糖SHP組分，酶 解提取法的多糖得率達(dá)2. 52%。
[0035] (3)徑向流脫色脫蛋白工藝
[0036] 將步驟（2)得到的粗多糖加水配制得到7mg/ml濃度的銅藻粗提液，加入裝填 有A103S陰離子樹脂的徑向流色譜柱（所用徑向流色譜柱為美國S印ragen公司的型號 SUPERFL0-250 COLUMN的徑向流色譜柱）中，用純水洗脫，徑向流色譜的條件為：上樣流速/ 柱高為3ml/(min · cm)，洗脫速度/柱高為12ml/(min · cm)，柱體積/上樣量為5mL/mL，洗 脫30min，收集得到洗脫液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)將上清液濃縮，經(jīng)冷凍干燥得SHPA多糖樣品。蛋白脫 除率達(dá)到89. 3 %，SHPA多糖含量為79. 6 %。
[0037] (4) SHPA酶解及純化：
[0038] 取0. 4g SHPA溶于IOOmL乙酸-乙酸鈉緩沖液（pH 5. 0)配制成4mg/mL樣液，取 葡聚糖酶加入緩沖液（pH 5.0)配制成質(zhì)量濃度4%酶溶液。將樣液IOmU酶液ImL各自保 溫lOmin，混勾，于50°C反應(yīng)2h，沸水浴加熱5min鈍化酶活性終止反應(yīng)。靜置冷卻，減壓蒸 發(fā)濃縮至4 %待用。
[0039] 選取孔徑大小為500Da規(guī)格的透析袋，裝入可溶性固形物4%的15mL酶解反應(yīng)液 分別流水透析24h，靜置過夜。重復(fù)多次，并將透析液減壓濃縮至10mL，冷凍干燥，儲備待 用。
[0040] 將酶解產(chǎn)物組分配制成10~20mg/mL的水溶液，過孔徑為0. 45 μ m微孔濾膜 (φ50 mm >，所得濾液進(jìn)行離子柱上樣。
[0041] (5)離子柱層析：DEAE-Sepharose Fast Flow 離子柱 CKK 26 X IOOcm)層析系統(tǒng)， 上樣量15mL，上樣流速為2mL/min ;分別以蒸餾水、0. lmol/L NaCl水溶液進(jìn)行洗脫，洗脫流 速為3. 5mL/min，自動分部收集器收集洗脫液，每管8mL。繪制洗脫曲線，并分別收集各洗脫 峰所對應(yīng)的組分。
[0042] 選定最大洗脫峰對應(yīng)洗脫液濃縮至5mg/mL左右濃度，用孔徑為0. 45 μ m微孔濾膜(φ5〇 mm)過濾，待凝膠柱層析。
[0043] (6)凝膠柱層