一種具有重金屬富集能力的真菌的篩選方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于環(huán)境修復(fù)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種具有重金屬富集能力的真菌的篩選方法。
【背景技術(shù)】
[0002]重金屬是一種重要的污染物。目前我國(guó)環(huán)境重金屬污染嚴(yán)重，據(jù)環(huán)保部最新一次土壤環(huán)境質(zhì)量調(diào)查結(jié)果顯示，全國(guó)土壤總的點(diǎn)位超標(biāo)率為16.1%，其中以重金屬等無(wú)機(jī)污染為主，占全部超標(biāo)點(diǎn)位的82.8%。其中鎘、汞、砷、銅、鉛、鉻、鋅、鎳8種無(wú)機(jī)污染物點(diǎn)位超標(biāo)率分別為7.0%、1.6%、2.7%、2.1%、1.5%、1.1%、0.9%、4.8%。土壤中的重金屬可通過(guò)食物鏈等途徑進(jìn)入人體，從而引發(fā)一系列疾病。如汞可以導(dǎo)致水俁病，鎘可以導(dǎo)致痛痛病等。因此，對(duì)重金屬污染土壤的修復(fù)刻不容緩。
[0003]目前有物理、化學(xué)和生物等三種方法可以修復(fù)重金屬污染土壤。生物方法具有高效、廉價(jià)以及無(wú)二次污染的優(yōu)點(diǎn)，因此更適合農(nóng)田土壤重金屬污染修復(fù)。目前生物修復(fù)中主要采用植物對(duì)重金屬進(jìn)行修復(fù)。該方法的原理是通過(guò)種植重金屬超富集植物，通過(guò)根部吸收土壤中的重金屬并運(yùn)輸?shù)降厣喜抠A存，從而達(dá)到去除土壤中重金屬的目的。該方法具有一定程度上可以去除重金屬，但是也存在諸多弊端。比如篩選出的重金屬富集植物種類還很有限，無(wú)法滿足目前重金屬修復(fù)的需要；很多富集植物環(huán)境適應(yīng)能力差，在異地修復(fù)時(shí)成活率低；植物生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，修復(fù)效率相對(duì)較低。
[0004]中國(guó)專利CN101088645B (申請(qǐng)?zhí)?200710049533.9，申請(qǐng)日:2007-07-17)披露了一種重金屬污染土壤的菌-草修復(fù)技術(shù)，其特征在于在污染土壤上采用間作或輪作方式種植對(duì)重金屬具強(qiáng)富集能力的蕈菌和草本植物來(lái)富集重金屬離子，成熟后的蕈菌經(jīng)腐爛或經(jīng)粉碎、勻漿、過(guò)濾，采用化學(xué)電泳或螯合沉淀方法將蕈菌漿液中的重金屬離子去除。該方法為重金屬污染土壤的修復(fù)開(kāi)辟了新途徑，采用大型真菌修復(fù)重金屬污染土壤具有多種優(yōu)勢(shì):首先，多種大型真菌具有富集重金屬的功能，有些大型真菌還可以同時(shí)富集多種重金屬；其次，大型真菌可以在添加栽培材料的土壤中生長(zhǎng)；再次，大型真菌生長(zhǎng)期短，并可以多次生長(zhǎng)，具有較大生物量，吸收重金屬量較為可觀；最后，大型真菌環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)，在異地修復(fù)中也能發(fā)揮作用(參考文獻(xiàn):周啟星，安鑫龍，魏樹(shù)和.大型真菌重金屬污染生態(tài)學(xué)研宄進(jìn)展與展望.應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2008)。但是目前，大型真菌對(duì)重金屬的富集能力較低，從而限制該技術(shù)的進(jìn)一步應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足而提供一種具有重金屬富集能力的真菌的篩選方法，采用該方法獲得的真菌不僅可以對(duì)含重金屬的廢水進(jìn)行快速處理，也可以通過(guò)后期的栽培技術(shù)吸收土壤中的重金屬，從而達(dá)到土壤修復(fù)目的，且具有效率高、成本低、速度快等優(yōu)點(diǎn)。
[0006]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案: 一種具有重金屬富集能力的真菌的篩選方法，包括如下步驟:
(O菌種的活化:收集真菌菌種，將不同的真菌菌種分別接種于PDA固體培養(yǎng)基上，于20~40°C 避光培養(yǎng) 5~30d ；
(2)耐重金屬真菌的篩選:從步驟(I)得到菌體中截取直徑為4~6mm的菌塊分別轉(zhuǎn)接于含重金屬濃度為100mg/L的PDA液體培養(yǎng)基中，于20~40°C、50~300rpm條件下在搖床中避光培養(yǎng)5~30d ；
(3)耐重金屬能力的馴化:從步驟(2)中獲得的菌體中截取直徑為4~6mm的菌塊接種于新的含重金屬濃度為150mg/L的PDA液體培養(yǎng)基中，于20~40°C、50~300rpm條件下在搖床中避光培養(yǎng)5~30d ；
(4)從步驟(3)中獲得的菌體中截取直徑為4~6mm的菌塊分別接種于新的含重金屬濃度為200mg/L的PDA液體培養(yǎng)基中，于20~40°C、50~300rpm條件下在搖床中避光培養(yǎng)5~30d；
(5)重復(fù)步驟(4)操作，每次將新的PDA液體培養(yǎng)基中含重金屬濃度提高50mg/L，其它操作條件不變，如此反復(fù)進(jìn)行，直至真菌不能正常生長(zhǎng)，此時(shí)新的PDA液體培養(yǎng)基中含重金屬濃度即為臨界耐重金屬濃度；
(6)真菌的篩選:將步驟(5)得到臨界耐重金屬濃度較高的真菌分別接種于含重金屬濃度100~400mg/L新的PDA液體培養(yǎng)基中，于20~40°C、50~300rpm條件下在搖床中避光培養(yǎng)5~30d，將菌絲濾出，用2.0moI/L硝酸溶液沖洗菌絲三次以洗去吸附態(tài)重金屬，烘干，稱重，分析菌絲中重金屬含量。
[0007]步驟(2)~ (4)中每一個(gè)步驟于28°C、150rpm條件下在搖床中避光培養(yǎng)8~10d。
[0008]步驟(1)~ (6)中所涉及的PDA固體培養(yǎng)基和PDA液體培養(yǎng)基需經(jīng)滅菌處理后使用。
[0009]所述真菌菌種選擇毛頭鬼傘、糙皮側(cè)耳、草菇和雙孢菇。
[0010]所述重金屬為鉛、鎘、鉻和砷中的任意一種。
[0011]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明取得的有益效果:
1.可以快速篩選得到具有重金屬耐受和吸收能力的真菌；
2.經(jīng)馴化后，真菌的重金屬耐受和吸收能力進(jìn)一步提高；
3.可以把真菌接種于含重金屬的廢水中，對(duì)廢水進(jìn)行處理；
4.可以通過(guò)后期的栽培技術(shù)吸收土壤中的重金屬，從而達(dá)到土壤修復(fù)目的。
【具體實(shí)施方式】
[0012]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步的描述，但是并不限制本發(fā)明的內(nèi)容；
下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法；
下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0013]實(shí)施例1
實(shí)驗(yàn)中使用到的兩種培養(yǎng)基:
PDA固體培養(yǎng)基:馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂15~20g、水1000mL、pH5，121°C滅菌20分鐘備用。
[0014]PDA液體培養(yǎng)基:馬鈴薯200g、葡萄糖20g、水lOOOmL、pH5，121°C滅菌20分鐘備用。
[0015]毛頭鬼傘、糙皮側(cè)耳、草菇和雙孢菇均屬大型真菌，可長(zhǎng)出子實(shí)體，為本實(shí)驗(yàn)室保存。
[0016]一種具有重金屬富集能力的真菌的篩選方法，包括如下步驟:
(O菌種的活化:將真菌菌種毛頭鬼傘、糙皮側(cè)耳、草菇和雙孢菇分別接種于PDA固體培養(yǎng)基上，于28 °C避光培養(yǎng)7d ；
(2)耐重金屬真菌的篩選:從步驟(I)得到菌體中截取直徑為5_的菌塊接于鉛濃度為100mg/L的PDA液體培養(yǎng)基中，于28°C、150rpm條件下在搖床中避光培養(yǎng)1d ；
(3)耐重金屬能力的馴化:將步驟(2)得到的菌體截取直徑為5_的菌塊分別接種于新的鉛濃度為150mg/L的PDA液體培養(yǎng)基中，于28°C、150rpm條件下在搖床中避光培養(yǎng)1d ；
(4)將步驟(3)得到的菌體截取直徑為5mm的菌塊分別接種于新的鉛濃度為200mg/L的PDA液體培養(yǎng)基中，于28°C、150rpm條件下在搖床中避光培養(yǎng)1d ；
(5)重復(fù)步驟(4)操作，每次將新的PDA液體培養(yǎng)基中鉛濃度提高50mg/L，其它操作條件不變，如此反復(fù)進(jìn)行，直至菌絲不能正常生長(zhǎng)為止，此時(shí)PDA液體培養(yǎng)基中鉛濃度即為臨界耐鉛濃度；
(6)真菌的篩選:將步驟(5)得到的臨界耐鉛濃度較高的菌種接種于鉛濃度為400mg/L的新的PDA液體培養(yǎng)基中，于28°C、150rpm條件下在搖床中避光培養(yǎng)10d，將菌絲濾出，用2.0mol/L硝酸溶液沖洗菌絲三次，烘干，稱重，分析菌絲中重金屬的含量，計(jì)算富集系數(shù)，富集系數(shù)高于10具有重金屬富集能力的真菌(富集系數(shù)=菌絲中重金屬含量/培養(yǎng)基中重金屬初始含量)。
[0017]經(jīng)過(guò)本實(shí)驗(yàn)所篩選和馴化，發(fā)現(xiàn)糙皮側(cè)耳對(duì)鉛的耐受能力較高，在900mg/L的鉛濃度下仍可繼續(xù)生長(zhǎng)，對(duì)鉛的富集系數(shù)達(dá)到25.6。而毛頭鬼傘、草菇和雙孢菇分別在300ppm，400ppm和450ppm鉛濃度的培養(yǎng)基中便不能正常生長(zhǎng)。結(jié)合適當(dāng)?shù)墓に?，糙皮?cè)耳有望用于鉛污染的廢水和土壤處理中。
[0018]實(shí)施例2
實(shí)驗(yàn)中使用到的兩種培養(yǎng)基:
PDA固體培養(yǎng)基:馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂15~20g、水1000mL、pH5，121°C滅菌20分鐘備用。
[0019]PDA液體培養(yǎng)基:馬鈴薯200g、葡萄糖20g、水lOOOmL、pH5，121°C滅菌20分鐘備用。
[0020]毛頭鬼傘、糙皮側(cè)耳、草菇和雙孢菇均屬大型真菌，可長(zhǎng)出子實(shí)體，為本實(shí)驗(yàn)室保存。
[0021]一種具有重金屬富集能力的真菌的篩選方法，包括如下步驟:
(O菌種的活化:將真菌菌種毛頭鬼傘、糙皮側(cè)耳、草菇和雙孢菇分別接種于PDA固體培養(yǎng)基上，于28 °C避光培養(yǎng)7d ；
(2)耐重金屬真菌的篩選:從步驟(I)得到菌體中截取直徑為5_的菌塊接于鎘濃度為100mg/L的PDA液體培養(yǎng)基中，于28°C、150rpm條件下在搖床中避光培養(yǎng)1d ；
(3)耐重金屬能力的馴化:將步驟(2)得到的菌體截取直徑為5_的菌塊分別接種于新的鎘濃度為150mg/L的PDA液體培養(yǎng)基中，于28°C、150rpm條件下在搖