一種用于乳酸菌耐藥性測定的通用培養(yǎng)基及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種用于細菌耐藥性測定的培養(yǎng)基，尤其涉及一種用于乳酸菌耐藥性 測定的通用培養(yǎng)基。
【背景技術(shù)】
[0002] 乳酸菌（lactic acid bacteria)是一類可發(fā)酵糖主要產(chǎn)生大量乳酸的細菌的 通稱，主要為乳桿菌屬（Lactobacillus)、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium)和鏈球菌屬 (Streptococcus)。乳酸菌為益生菌，在食品和醫(yī)藥工業(yè)中占據(jù)越來越重要的地位，然而，隨 著抗生素的廣泛使用，使乳酸菌對多種類型的抗生素產(chǎn)生不同程度的耐藥性（健康人體及 保健品中乳酸菌和雙歧桿菌的抗藥性分析，中國食品學報，2009年，第9卷第6期），另一方 面，由于目前在構(gòu)建乳酸菌的基因克隆與表達系統(tǒng)大都采用以抗生素抗性基因作為選擇標 記，存在抗藥性基因轉(zhuǎn)移和擴散的可能性，使得乳酸菌的生物安全性問題引起廣泛重視。因 此，測定乳酸菌的耐藥性對于保證其安全性乃至保障人類健康具有重要現(xiàn)實意義。
[0003] 目前醫(yī)學領(lǐng)域測定致病菌，對不同抗生素的敏感性，已形成一套完善的實驗方 法，如美國國家臨床實驗室標準化委員會（NCCLS)，推薦的"抗菌藥物敏感性試驗執(zhí)行標 準"（Performance standards for antimicrobial susceptibility testing)。我國醫(yī)學 微生物實驗室采用這一標準，目的在于通過實驗篩選出針對目標致病菌敏感的抗生素種類 及最小抑制量，從而用于治療。然而，對于細菌耐藥性試驗，由于沒有相應(yīng)的方法標準，通常 情況下參考上述標準，其中的藥敏紙片瓊脂擴散法（K-B法），就是耐藥性試驗常采用方法 之一。但就乳酸菌而言，由于乳酸菌對營養(yǎng)因子特殊的需求，該標準所推薦的培養(yǎng)基，不能 滿足對不同菌屬的乳酸菌同時測定耐藥性的需求。
[0004] 乳酸囷主要包括乳桿囷屬、雙歧桿囷屬和鏈球囷屬，其中乳桿囷屬、雙歧桿囷屬需 在厭氧環(huán)境下生長，而鏈球菌則在需氧環(huán)境下生長，除此之外，這三個不同屬的細菌，對營 養(yǎng)的需求也不同。目前對乳酸桿菌、雙歧桿菌和嗜熱鏈球菌，這三種菌屬的培養(yǎng)通常使用 不同的培養(yǎng)基，如用于乳酸桿菌培養(yǎng)的乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基（GB 5413. 14、GB 5413. 15、GB 5413. 16、GB 5413. 17、GB 5413. 19)、MRS 培養(yǎng)基（GB 4789. 35)等；用于雙歧桿菌培養(yǎng)的 雙歧桿菌培養(yǎng)基（GB 4789. 34)、改良MRS(添加了抑制乳桿菌屬生長的莫匹羅星鋰鹽，GB 4789. 35);用于嗜熱鏈球菌培養(yǎng)的MC培養(yǎng)基（GB 4789. 35)、M17培養(yǎng)基等，換言之，目前的 除能同時支持乳酸桿菌和雙歧桿菌生長的培養(yǎng)基外，尚沒有能夠支持包括乳酸桿菌、雙歧 桿菌和嗜熱鏈球菌三種菌生長的通用培養(yǎng)基。
[0005] 對乳酸菌的耐藥性測定只能使用不同培養(yǎng)基，乳桿菌屬、雙歧桿菌屬耐藥性測定 以MRS培養(yǎng)基為主，對鏈球菌屬則采用M17培養(yǎng)基或者其他培養(yǎng)基，如此一來，不僅給實驗 人員帶來不便，而且不便于室內(nèi)和室間結(jié)果比較，測定方法難以統(tǒng)一規(guī)范，并且檢測成本比 較高。如果能有一種培養(yǎng)基用于乳酸菌中不同屬細菌耐藥性測定，不僅提高檢測效率，還將 為耐藥性測定結(jié)果的準確性提供了保證。
[0006] 綜上所述，目前使用沒有一種培養(yǎng)基適用于三種不同類型乳酸菌耐藥性測定，其 技術(shù)瓶頸在于：如何選擇和優(yōu)化出一組促生長因子，以組合成一種可以滿足三種不同類型 乳酸菌較好生長的培養(yǎng)基，同時，所添加成分不能對各類試驗抗生素產(chǎn)生影響，造成結(jié)果偏 差。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的一個目的在于提供一種用于乳酸菌耐藥性測定的通用培養(yǎng)基。已解決現(xiàn) 有技術(shù)中沒有能同時用于乳桿菌屬、雙歧桿菌屬和鏈球菌屬三種菌屬的乳酸菌耐藥性測試 的培養(yǎng)基。
[0008] -種用于乳酸菌耐藥性測定的通用培養(yǎng)基，其中，每1000 mL的培養(yǎng)基包括：蛋白 胨7~15g，牛肉浸粉3~7g，酵母粉2~4g，葡萄糖15~25g，抗壞血酸棕櫚酸醋0. 8~ I. 2g，維生素 B6為2. 6mg，半胱氨酸鹽酸鹽0. 5~lg，泊洛沙姆I. 0~2. 0g，硫酸鎂0. 1~ 0· 3g，MnSO4. 4H20 0· 05g，β -甘油磷酸二鈉15~25g，瓊脂15~20g，余量為水，pH為 6. 2±0. 2。
[0009] 在一些實施例中，優(yōu)選為，所述蛋白胨為胰酪胨、大豆胨、細菌蛋白胨或胰酪胨和 大豆胨的混合物。
[0010] 在一些實施例中，優(yōu)選為，所述維生素 B6為吡哆醇、鹽酸吡哆醛或吡哆胺。
[0011] 在一些實施例中，優(yōu)選為，所述泊洛沙姆為泊洛沙姆188。
[0012] 在一些實施例中，優(yōu)選為，所述蛋白胨為胰酪胨5g和大豆胨5g ;所述牛肉浸粉為 5g，所述酵母粉為3g，所述葡萄糖為20g，所述抗壞血酸棕櫚酸酯為lg，所述維生素 B6為 鹽酸吡哆醛，所述半胱氨酸鹽酸鹽為0. 5g，所述泊洛沙姆為I. 2g，所述硫酸鎂為0. 2g，所述 β -甘油磷酸二鈉為19g，所述瓊脂為13g。
[0013] 本發(fā)明的另一個目的在于提供一種使用上述通用培養(yǎng)基測定乳酸菌對抗生素耐 藥性的方法。具體如下：
[0014] 一種用于測定乳酸菌對抗生素耐藥性實驗的方法，包括如下步驟：
[0015] 1)平板制備：稱取上述培養(yǎng)基的各組分，加入到去離子水中，攪拌，加熱至完全溶 解，調(diào)節(jié)pH至6. 2±0. 2,高壓滅菌后，待冷卻至45°C~55°C，無菌操作倒平板，備用；
[0016] 2)受試菌和標準對照菌的活化與培養(yǎng)：受試菌與標準對照菌分別在各自最適 溫度下活化2~3代，分別以0. 5~1. 5 %接種量接種液體培養(yǎng)基，在最適溫度下厭氧 或好氧培養(yǎng)12h左右，采用標準比濁溶液測定菌液的OD值，使菌液濃度在I. 5X IO8~ 3. 0X 108cfu/mL 范圍；
[0017] 3)接種：分別吸取受試菌與標準對照菌0. lmL，接種于所述步驟1制備的培養(yǎng)基 上，涂布均勻，放置7~15min，使培養(yǎng)基表面干燥；
[0018] 4)藥敏紙片貼放及培養(yǎng)：將標準藥敏紙片貼放所述步驟1制備的固體培養(yǎng)基表 面，每皿4片，紙片外沿距平皿外沿15~20mm，紙片間距20mm，然后將平皿倒置在培養(yǎng)箱或 充N 2的厭氧罐中，于最適溫度下培養(yǎng)18~20h，對生長緩慢者培養(yǎng)48h ;
[0019] 5)結(jié)果分析：測量抑菌圈寬度并判斷受試菌對抗生素的敏感性測量受試菌與標 準對照菌的抑菌圈寬度，判斷受試菌抗生素的敏感性結(jié)果。
[0020] 如上所述的方法，優(yōu)選地，所述受試菌包括乳桿菌、雙歧桿菌和/或嗜熱鏈球菌。
[0021] 如上所述的方法，優(yōu)選地，所述標準對照菌為金黃色葡萄球菌。
[0022] 如上所述的方法，優(yōu)選地，所述最適合溫度為36°C ±1°C。
[0023] 如上所述的方法，優(yōu)選地，所述判斷的標準為：當受試菌的抑菌圈寬度大于或等于 標準對照菌的抑菌圈寬度，或者前者小于后者，但兩者之差小于3_判為敏感；當受試菌的 抑菌圈寬度大于3mm，但小于標準對照的抑菌圈寬度，且二者之差大于3mm為中度敏感；當 抑菌圈的寬度小于或等于3mm，為耐藥。
[0024] 本發(fā)明的培養(yǎng)基可用于乳酸菌中三種不同類型菌種同時生長，培養(yǎng)基的成分對各 類試驗抗生素不會產(chǎn)生影響，采用本發(fā)明的培養(yǎng)基，通過各類抗生素對乳酸菌耐藥性測試， 可作為乳酸菌耐藥性測定的通用培養(yǎng)基使用，大大降低了檢測成本，并且減少操作步驟，降 低工作人員的勞動強度。
[0025] 本發(fā)明的培養(yǎng)基用于乳酸菌的耐藥性測定，具有支持乳酸菌生長的包容性強、靈 敏度高、易于操作、結(jié)果判斷簡單等優(yōu)點，適合醫(yī)學臨床微生物檢驗、食品安全微生物檢測、 環(huán)境保護等領(lǐng)域，有廣泛的應(yīng)用前景，國內(nèi)外沒有同類產(chǎn)品。
[0026] 本發(fā)明培養(yǎng)基與現(xiàn)有培養(yǎng)基相比，具有較強的通用性和專用性，更易于用于測定 乳酸菌的耐藥性。
【具體實施方式】
[0027] 本發(fā)明在培養(yǎng)基中添加了蛋白胨為乳酸菌的生長提供充足氮源，牛肉浸出粉補充 蛋白胨的功效，酵母粉為乳酸菌生長提供了促進生長和平衡代謝的B族維生素及微量元 素，葡萄糖為細菌生長提供碳源。
[0028] 本發(fā)明在培養(yǎng)基中添加了抗壞血酸棕櫚酸酯，為刺激乳酸桿菌生長提供了 Vc。
[0029] 本發(fā)明在培養(yǎng)基中添加了泊洛沙姆（商品名普流尼克），起增溶作用及利于代謝 物質(zhì)傳輸，優(yōu)選泊洛沙姆188。
[0030] 本發(fā)明在配置培養(yǎng)基時，pH為6. 2±0. 2是指pH的范圍在6. 0到6. 4之間