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      一種利用dna條形碼鑒別茶樹品種的方法

      文檔序號:9231141閱讀:921來源:國知局
      一種利用dna條形碼鑒別茶樹品種的方法
      【技術(shù)領(lǐng)域】
      [0001] 本發(fā)明涉及茶樹品種的鑒別方法。
      【背景技術(shù)】
      [0002] 我國目前已選育了 114個國家級良種和154個省級良種,如何對這些品種進行準 確鑒定對育種者權(quán)益保護和新品種推廣等具有重要意義。茶樹新品種DUS(特異性、一致 性、穩(wěn)定性的簡稱)測試指南是中國為國際植物新品種保護聯(lián)盟(UPOV)制訂的第一個植物 新品種DUS測試指南,它的制定為我國茶樹資源評價和保護提供了技術(shù)基礎(chǔ)和授權(quán)依據(jù)。 隨著分子標記技術(shù)不斷發(fā)展,UPOV已將DNA標記鑒定納入農(nóng)作物品種DUS測試內(nèi)容。DNA 分子標記技術(shù)不僅具有穩(wěn)定性、品種間變異的可識別性、最小品種內(nèi)變異及實驗結(jié)果的可 靠性,而且具有簡便、迅速等優(yōu)點,非常適合品種鑒定,克服了傳統(tǒng)形態(tài)標記鑒定周期長、誤 差大、性狀差異小的缺點。國際植物品種權(quán)保護聯(lián)盟(UPOV)在BMT測試指南草案中已將構(gòu) 建DNA指紋數(shù)據(jù)庫的標記方法確定為SSR和SNP。而SSR標記因引物開發(fā)廉價、操作簡單、 易于推廣,已被UPOV生物化學和分子技術(shù)工作組驗證為植物新品種保護最廣泛應(yīng)用的標 記體系。UPOV雖已將作物SSR標記鑒定納入農(nóng)作物品種DUS測試內(nèi)容,但對不同作物的測 試流程及具體方法卻沒有明確的規(guī)定。

      【發(fā)明內(nèi)容】

      [0003] 針對目前依靠茶樹植物學性狀對茶樹品種進行鑒定周期長、誤差大、鑒定性狀差 異小品種困難大、對鑒定者經(jīng)驗要求豐富等問題,本發(fā)明提供了一種簡單、快速、準確利用 DNA條形碼鑒別茶樹品種的方法。
      [0004] 本發(fā)明解決上述技術(shù)問題采用的技術(shù)方案是:一種利用DNA條形碼鑒別茶樹品種 的方法,包括以下步驟:
      [0005] (I) DNA提取:分別提取數(shù)個茶樹品種的DNA ;
      [0006] (2)引物篩選:篩選條帶清晰、穩(wěn)定且重復性好的數(shù)對SSR引物;
      [0007] (3) PCR擴增:將上述提取的DNA中的每個DNA分別與每對篩選的SSR引物混合配 成PCR反應(yīng)試劑進行擴增;
      [0008] (4) SSR標記的PCR產(chǎn)物分析:將每一 PCR反應(yīng)產(chǎn)物進行凝膠電泳后染色,然后采 用凝膠成像儀拍照記錄;
      [0009] (5)分子條形碼的構(gòu)建:將上述記錄的每對SSR引物上的每一個品種的電泳圖上 清晰的條帶記為"1",同一位置無帶或不易分辨的弱帶計為"〇",建立原始數(shù)據(jù)庫;然后把 每對SSR引物上每一個品種位點的1、0數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為字母;再將數(shù)對SSR引物上對應(yīng)品種轉(zhuǎn) 換的字母進行組合,形成每一個品種的DNA條形碼;
      [0010] (6)鑒別:以上述DNA條形碼為標準鑒別茶樹品種的真?zhèn)巍?br>[0011] 作為優(yōu)選,采用試劑盒法提取DNA。
      [0012] 作為優(yōu)選,篩選出
      [0013] F:CTCCGATTACTTTCTTCC
      [0014] R:GCAGGTTAGCGGTGGTTA ;
      [0015] F:TAGGGTTTTAGTTTCAG
      [0016] R:AACATCCTTGCCTCGTC ;
      [0017] F:GTGAAGTTAGTTGTTACTCTTTTTTGG
      [0018] RiAGGGGAAGTGAGGAGGCAT ;
      [0019] F:ATGCTTCAGGGAGTGACCAT
      [0020] R:ATTTATGCCAAACTACCAACAG
      [0021] 四對SSR引物。
      [0022] 作為優(yōu)選,每一 PCR反應(yīng)試劑按體積份數(shù)6. 65份ddH20、I. 0份IOng/ μ L的上述 提取的一個品種的 DNA、1. 0 份 10XBuffer、0. 7 份 25mM 的 Mg2+、0. 2 份 IOmM 的 dNTP、各 0. 1 份 10 μ M 的 primers 和 0· 25 份 2U/ μ L 的 Taq polymerase 混合配成而成。
      [0023] 作為優(yōu)選,PCR擴增條件為94°C變性3min,然后94°C變性30s,53°C退火30s,72°C 延伸50s,共30個循環(huán),完成以上循環(huán)以后,72°C延伸IOmin,最后將PCR產(chǎn)物冷卻到室溫或 者 4。。。
      [0024] 作為優(yōu)選,上述PCR擴增重復一次,比較兩次擴增結(jié)果,如果兩次結(jié)果不一致,PCR 擴增再重復一次,以有兩次擴增一致的結(jié)果為準。
      [0025] 作為優(yōu)選,將PCR產(chǎn)物與6Xloading buffer混合,采用10%的聚丙稀酰胺凝膠電 泳,電泳后進行硝酸銀染色,直到有清晰條帶出現(xiàn)為止。
      [0026] 作為優(yōu)選,硝酸銀染色的步驟為:①用10%乙醇和0. 5%乙酸固定5~8min ;②用 10%乙醇和0. 5%乙酸再次固定5~8min ;③用0. 2% AgNO3染色10~15min ;④用蒸餾水 沖洗數(shù)秒;⑤用I. 5% NaOH和0. 5%甲醛顯色。
      [0027] 作為優(yōu)選,1、0數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為字母的規(guī)則為:①有2個位點,按位點的大小只有第一 個位點的編碼為A ;只有第二個位點的編碼為B ;兩個位點都有的編碼為C ;兩個位點都沒 的有編碼為N ;②有3個位點,只有1個位點的按大小依次編碼為A、B、C ;只有2個位點的, 按位點組合依次編碼為D、E、F ;三個位點都有的編碼為G ;如果三個位點都沒有編碼為N ; ③有4個位點,只有1個位點的按大小依次編碼為A、B、C、D ;只有2個位點則編碼字母從E 開始,按位點組合依次編碼為E、F、G、H、I、J ;只有3個位點的按位點組合從K開始依次編 碼為K、L ;4個位點都有的編碼為M,4個位點都沒有的編碼為N。
      [0028] 從以上技術(shù)方案可知,本發(fā)明利用分子標記技術(shù),通過基因組DNA提取、標記篩 選、PCR擴增、產(chǎn)物分析、條帶數(shù)據(jù)讀取和字母條形碼的建立等技術(shù)組合,建立了一種DNA條 形碼鑒別茶樹品種的方法,該方法與傳統(tǒng)形態(tài)學鑒定方法相比,不受環(huán)境條件影響,方法簡 單、快速、準確,可對茶樹品種的真實性進行準確鑒定。
      【附圖說明】
      [0029] 圖1是引物234的擴增結(jié)果圖。
      [0030] 圖2是引物685的擴增結(jié)果圖。
      [0031] 圖3是引物A58的擴增結(jié)果圖。
      [0032] 圖4是引物A142的擴增結(jié)果圖。
      【具體實施方式】
      [0033] 下面結(jié)合附圖詳細介紹本發(fā)明:
      [0034] 本發(fā)明用櫧葉齊、湘波綠2號、福鼎大白茶、玉綠和尖波黃13號共5個品種來做測 試樣品。首先,DNA提取方法按照試劑盒提供的步驟進行,最后溶解DNA到IOOul。Nanodrop 檢測DNA濃度,DNA的濃度用重蒸水稀釋到10-20ng/ul的濃度。
      [0035] 接著,篩選條帶清晰、穩(wěn)定且重復性好的4對SSR引物,具體引物信息如下表1。
      [0037] 表1篩選的引物信息
      [0038] 然后,按照表2的試劑配方,先將除DNA之外的其它6種試劑進行混合,混合時Taq polymerase最后加入,然后分裝成5份分別加入20ulPCR試管中,最后在每個管試中分別加 入 lulDNA。
      [0041] 表2 IOuIPCR反應(yīng)體系試劑配方
      [0042] 將上述試管置于PCR儀中進行擴展,擴展程序為:94°C變性3min,94°C變性30s, 53°C退火30s,72°C延伸50s,共30個循環(huán),完成以上循環(huán)以后,72°C延伸lOmin,最后將PCR 產(chǎn)物冷卻到室溫或者4°C。從PCR儀取出以后進行分析。產(chǎn)物的分析為聚丙烯酰胺凝膠電 泳:移取4ul的PCR產(chǎn)物混合Iul 6 X loading
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