一種用于我國養(yǎng)殖與野生三疣梭子蟹微孢子蟲感染早期預(yù)警的套式引物及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于三疣梭子蟹疾病防治領(lǐng)域，特別涉及一種用于我國養(yǎng)殖與野生三疣梭 子蟹微孢子蟲感染早期預(yù)警的套式引物及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 三疣梭子蟹是我國重要的漁業(yè)生產(chǎn)對(duì)象，也是重要的高經(jīng)濟(jì)價(jià)值水產(chǎn)養(yǎng)殖品種， 然而近年來"牙膏病"的流行對(duì)三疣梭子蟹養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大威脅。本實(shí)驗(yàn)室通過病理學(xué) 和分子生物學(xué)等方法證明了其病原為一種微孢子蟲。三琉梭子蟹微孢子蟲病雖然發(fā)病較為 緩慢，但是傳染性很強(qiáng)。該病初期感染特征較為隱蔽，在培育中后期才表現(xiàn)典型癥狀，病蟹 喪失經(jīng)濟(jì)價(jià)值，經(jīng)濟(jì)損失很大。因此，建立三疣梭子蟹微孢子蟲的早期診斷技術(shù)，對(duì)于養(yǎng)殖 三疣梭子蟹"牙膏病"的防治和預(yù)警均具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。
[0003] 目前我國三疣梭子蟹育苗在很大程度上仍然依賴海捕的野生三疣梭子蟹。由于微 孢子蟲的傳播方式是垂直傳播和水平傳播共存，如果野生親蟹攜帶微孢子蟲，則不僅導(dǎo)致 出苗率下降，還極易垂直傳播給子代，導(dǎo)致子代育成率下降，或終身帶毒，生長(zhǎng)速度下降，發(fā) 生"牙膏樣"病變的則經(jīng)濟(jì)價(jià)值喪失，因此，野生親蟹微孢子蟲微量感染的早期診斷尤其重 要。分子PCR診斷技術(shù)由于快速、簡(jiǎn)便、樣品組織需要量小，因而，適于三疣梭子蟹尤其是親 蟹和蟹苗微孢子蟲微量感染的快速診斷。但是，還未見到關(guān)于我國野生三疣梭子蟹微孢子 蟲流行種的鑒定和序列分析的報(bào)道，也沒有針對(duì)我國養(yǎng)殖與野生微孢子蟲流行種特異的分 子檢測(cè)技術(shù)。
[0004] 由于微孢子蟲是細(xì)胞內(nèi)寄生生物，還具有堅(jiān)硬的幾丁質(zhì)外殼，不僅影響DNA的提 取效率，而且容易出現(xiàn)較短的片段，因此，國內(nèi)外基于通用引物（擴(kuò)增長(zhǎng)片段）的微孢子蟲 的檢出率比細(xì)菌、病毒等病原的檢出率要低許多，定量PCR技術(shù)雖然靈敏度有一定提高，但 是檢測(cè)成本大幅提高，而且對(duì)儀器要求較高。套式PCR技術(shù)通過設(shè)計(jì)內(nèi)、外兩對(duì)嵌套引物進(jìn) 行兩輪擴(kuò)增，痕量的模板DNA被富集、擴(kuò)增到可以檢測(cè)的量，放大效率極高，且因?yàn)閮蓪?duì)引 物擴(kuò)增的目的基因是嵌套的，擴(kuò)增的特異性大大增強(qiáng)，達(dá)到高靈敏度、高特異性擴(kuò)增目的基 因的目的。該法與單對(duì)引物的普通PCR相比效率高出很多，與熒光定量PCR相比又相對(duì)簡(jiǎn) 單易行且成本低廉。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種用于我國養(yǎng)殖與野生三疣梭子蟹微孢子 蟲感染早期預(yù)警的套式引物及其應(yīng)用，該套式引物檢測(cè)靈敏度很高且特異性好，比通用引 物有大幅提高，適用于從微孢子蟲微量或潛伏感染的蟹的肌肉組織等樣品中早期檢測(cè)三疣 梭子蟹微孢子蟲，可在三疣梭子蟹微孢子蟲的分子檢測(cè)和疾病預(yù)警中應(yīng)用，具有良好的應(yīng) 用前景。
[0006] 本發(fā)明的一種用于我國養(yǎng)殖與野生三疣梭子蟹微孢子蟲感染早期預(yù)警的套式引 物，所述套式引物包括一對(duì)外引物MI1F/MI545R和一對(duì)內(nèi)引物MI230F/MI426R，具體序列如 下：
[0007] MIlF ：TGGCGACCAGTTCTAAG ；
[0008] MI545R ：AAGCCGAACAATCCACA ；
[0009] MI230F ：CARATAGATAGGGGCAGTAGC ；
[0010] MI426R ：ATCGGTCACTGCTAGAACTAC〇
[0011] 所述外引物MI1F/MI545R的擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為545bp。
[0012] 所述內(nèi)引物MI230F/MI426R的擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為197bp。
[0013] 本發(fā)明的一種用于我國養(yǎng)殖與野生三疣梭子蟹微孢子蟲感染早期預(yù)警的套式引 物的應(yīng)用，所述套式引物應(yīng)用于我國三疣梭子蟹微孢子蟲的分子檢測(cè)和疾病預(yù)警。
[0014] 經(jīng)過普通與超微病理分析以及基于通用引物的廣泛的流行病學(xué)調(diào)查表明，感染我 國養(yǎng)殖和野生三疣梭子蟹的微孢子蟲為同一個(gè)種，具有完全相同的SSU rRNA基因序列，但 是該序列與已知的最為接近的微孢子蟲序列也存在較多的堿基差異。據(jù)此，本發(fā)明設(shè)計(jì)了 一套基于我國三疣梭子蟹微孢子蟲種特異序列的、養(yǎng)殖與野生蟹均適用的、較短的套式引 物。
[0015] 有益效果
[0016] 本發(fā)明檢測(cè)靈敏度很高且特異性好，比通用引物有大幅提高，適用于從微孢子蟲 微量或潛伏感染的蟹的肌肉組織等樣品中早期檢測(cè)三疣梭子蟹微孢子蟲，可在我國三疣梭 子蟹微孢子蟲的分子檢測(cè)和疾病預(yù)警中應(yīng)用，具有良好的應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0017] 圖1為本發(fā)明的套式引物對(duì)野生三疣梭子蟹肌肉中微孢子蟲的擴(kuò)增結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0018] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人 員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定 的范圍。
[0019] 實(shí)施例1
[0020] 分別應(yīng)用微孢子蟲通用引物（V1F/1492R)和套式引物（MI1F/MI545R和MI230F/ MI426R)對(duì)76份野生三疣梭子蟹樣品肌肉DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增試驗(yàn)。
[0021] 通用引物（V1F/1492R)擴(kuò)增體系和條件：擴(kuò)增體系共25yL，由I yL組織DNA模 板、I UL 正向引物 VlF(10yM)、l yL 反向引物 1492R(10yM)、12. 5yL 2X GoTaq? Green Master Mix(promega)和 9.5以1^無0嫩酶水組成。擴(kuò)增條件為：94°0 5111；[11，然后94°0 458， 45°C 35s，72°C 90s循環(huán)32次，最后72°C延伸lOmin。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外 凝膠成像儀觀察結(jié)果。
[0022] 套式引物外引物（MI 1F/MI545R)擴(kuò)增體系和條件：擴(kuò)增體系共25 μ L，由I yL組 織〇嫩模板、0.5以1^正向外引物肌卟（1(^]\〇、0.5 41^反向外引物肌5451?(1(^]\〇、12.5 41^ 2\0〇丁&9@6代611]\^8丨61]\^1&1'〇111683)和10.5以1^無0嫩酶水組成。擴(kuò)增條件為：95°〇 預(yù)變性 5min，然后 95°C 45s，47°C 35s，72°C，40s 循環(huán) 25 次，最后 72°C延伸 5min。PCR 產(chǎn)物 一部分用作內(nèi)引物模板，一部分經(jīng)I %瓊脂糖凝膠電泳，紫外凝膠成像儀觀察結(jié)果。
[0023] 套式引物內(nèi)引物（MI230F/MI426R)擴(kuò)增體系和條件：擴(kuò)增體系共25 μ L，由 I UL外引物擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物、0. 3yL正向內(nèi)引物MI230F(10yM)、0. 3yL反向內(nèi)引物 MI426R(10yM)、12.5yL 2X GoTaq?Green Master Mix(promega)和 10.9yL無 DNA 酶 水組成。擴(kuò)增條件為：95°C預(yù)變性5min，然后95°C 35s，50°C 30s，72°C 20s循環(huán)20次，最后 72 °C延伸5min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳，紫外凝膠成像儀觀察結(jié)果。
[0024] 圖1為其中20份樣品的套式引物擴(kuò)增結(jié)果。從電泳圖可以看出，套式引物擴(kuò)增的 條帶明亮而單一，無雜帶，特異性好。陽性結(jié)果經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證均為三疣梭子蟹微孢子蟲。通用 弓丨物和外引物以及套式引物對(duì)所有野生三疣梭子蟹樣品的檢測(cè)結(jié)果比較見表1。
[0025] 檢測(cè)結(jié)果說明：1、野生三疣梭子蟹中微孢子蟲含量極低，但是感染率較高，顯示了 建立特異而高度靈敏的微孢子蟲檢測(cè)技術(shù)的必要性；2、套式引物（MI1F/MI545R和MI230F/ MI426R)的特異性好且檢測(cè)靈敏度比通用引物大幅提高，適用于我國養(yǎng)殖和野生三疣梭子 蟹微孢子蟲微量感染或潛伏感染的早期監(jiān)測(cè)和預(yù)警。
[0026] 表1不同引物對(duì)76份野生三疣梭子蟹樣品中微孢子蟲的擴(kuò)增結(jié)果
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于我國養(yǎng)殖與野生三疣梭子蟹微孢子蟲感染早期預(yù)警的套式引物，其特征在 于：所述套式引物包括一對(duì)外引物MI1F/MI545R和一對(duì)內(nèi)引物MI230F/MI426R，具體序列如 下： MIlF ：TGGCGACCAGTTCTAAG ； MI545R ：AAGCCGAACAATCCACA ； MI230F ：CARATAGATAGGGGCAGTAGC ； MI426R ：ATCGGTCACTGCTAGAACTAC〇2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于我國養(yǎng)殖與野生三疣梭子蟹微孢子蟲感染早期預(yù) 警的套式引物，其特征在于：所述外引物MI1F/MI545R的擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為545bp。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于我國養(yǎng)殖與野生三疣梭子蟹微孢子蟲感染早期預(yù) 警的套式引物，其特征在于：所述內(nèi)引物MI230F/MI426R的擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為197bp。4. 一種如權(quán)利要求1所述的用于我國養(yǎng)殖與野生三疣梭子蟹微孢子蟲感染早期預(yù)警 的套式引物的應(yīng)用，其特征在于：所述套式引物應(yīng)用于我國三疣梭子蟹微孢子蟲的分子檢 測(cè)和疾病預(yù)警。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用于我國養(yǎng)殖與野生三疣梭子蟹微孢子蟲感染早期預(yù)警的套式引物及其應(yīng)用，所述套式引物包括一對(duì)外引物MI1F/MI545R和一對(duì)內(nèi)引物MI230F/MI426R，具體序列如下：MI1F：TGGCGACCAGTTCTAAG；MI545R：AAGCCGAACAATCCACA；MI230F：CARATAGATAGGGGCAGTAGC；MI426R：ATCGGTCACTGCTAGAACTAC。本發(fā)明檢測(cè)靈敏度很高且特異性好，比通用引物有大幅提高，適用于從微孢子蟲微量或潛伏感染的蟹的肌肉組織等樣品中早期檢測(cè)三疣梭子蟹微孢子蟲，可在我國三疣梭子蟹微孢子蟲的分子檢測(cè)和疾病預(yù)警中應(yīng)用，具有良好的應(yīng)用前景。
【IPC分類】C12Q1/04, C12N15/11, C12R1/90, C12Q1/68
【公開號(hào)】CN104946747
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510289724
【發(fā)明人】周俊芳, 房文紅, 王浩, 王元, 周紅霞
【申請(qǐng)人】中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所
【公開日】2015年9月30日
【申請(qǐng)日】2015年5月29日