鑒定小麥葉銹菌生理小種thts特異引物應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種用于鑒定小麥葉銹菌生理小種的引物序列及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 由小麥葉銹菌引起的小麥葉銹病是世界麥區(qū)普遍發(fā)生的 病害之一，其發(fā)生與流行使小麥產(chǎn)量和品質(zhì)受到嚴(yán)重影響，是影響世界小麥生產(chǎn)的重要障 礙。由于小麥品種和發(fā)病時期不同，可造成7%-30%，甚至50%以上產(chǎn)量損失（Huerta-Espino et al. 2011)。實踐證明，控制該病害最經(jīng)濟、安全、有效方法是抗病品種的應(yīng)用。但品種抗 葉銹性的喪失是抗病品種應(yīng)用的一個嚴(yán)重問題，其主要原因是葉銹菌變異和新毒性小種 的產(chǎn)生。因此，小麥葉銹菌生理小種監(jiān)測及流行預(yù)報已成為防治小麥葉銹病、指導(dǎo)小麥抗病 品種選育和布局的重要環(huán)節(jié)。但小麥葉銹菌是一種專性寄生菌，無法進行人工培養(yǎng)，而 生理小種的常規(guī)鑒定與監(jiān)測方法繁雜、費工費時，準(zhǔn)確性也易受到鑒定條件的影響，因 此，需尋找一種簡便、快速、準(zhǔn)確性高的新方法。
[0003] 目前，DNA標(biāo)記技術(shù)已廣泛用于真菌群體生物學(xué)、流行學(xué)研究。RAPD、RFLP、AFLP和 SSR分子標(biāo)記已廣泛應(yīng)用于小麥葉銹菌群體遺傳結(jié)構(gòu)研究。其中SSR標(biāo)記因其多態(tài)性高、共 顯性、穩(wěn)定性好而得到了廣泛應(yīng)用，但目前小麥葉銹菌生理小種特異性的分子標(biāo)記還很少， 無法利用DNA分子標(biāo)記進行快速的小種鑒定。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種用于鑒定小麥葉銹菌生理小種的引物序列， 用于快速鑒定待測小麥葉銹菌生理小種類型。
[0005] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所述引物序列為Ptssr0125,由序列表中上游序列 (20個堿基）和下游序列（20個堿基）組成，表1。
[0006] 表1用于檢測抗葉銹基因的兩引物上下游序列
本發(fā)明所提供的用于鑒定小麥葉銹菌生理小種的分子標(biāo)記是PtSSr〇125,由引物 Ptssr0125擴增獲得200 bp和178bp條帶。
[0007] 本發(fā)明還提供了引物序列在篩選小麥葉銹菌生理小種中的應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明應(yīng)用的具體方法為：以待測小麥葉銹菌基因組DNA為模板，利用引物 Ptssr0125進行PCR擴增，再對擴增產(chǎn)物進行檢測；當(dāng)擴增產(chǎn)物同時有200bp和178bp條帶 時，則待測小麥葉銹菌株的生理小種類型為THTS。
[0009] 本發(fā)明應(yīng)用中所述的PCR擴增： 20 μL PCR反應(yīng)體系為：模板DNA 60 ng，Taq酶0.5 U，上、下游引物（5 μ mol ·〇 各0.4 μ L，dNTP (10 mmol ?I/1 )0. 4 μ L，10 X PCR緩沖液2 μ L，用無菌超純水補充反 應(yīng)體系至20 yL; PCR 反應(yīng)程序為：先 94 °C 5 min;然后 94 °C 30 s，55°C 30 s，72°C I min，共 35 個 循環(huán)；最后72 °C 5 min，4°C保存。
[0010] 本發(fā)明應(yīng)用中所述的對擴增產(chǎn)物進行檢測是：對擴增產(chǎn)物在10% (w/v)的非變性 聚丙烯酰胺凝膠中電泳分離，然后銀染顯色。
[0011] 采用上述技術(shù)方案所產(chǎn)生的有益效果在于：本發(fā)明提供了一個新的小麥葉銹菌生 理小種THTS的EST-SSR特異標(biāo)記，利用該標(biāo)記可快速鑒定、監(jiān)測生理小種THTS，從而為建立 具有實用價值的中國小麥葉銹菌生理小種的分子監(jiān)測技術(shù)體系奠定基礎(chǔ)。
【附圖說明】
[0012] 下面結(jié)合附圖和【具體實施方式】對本發(fā)明作進一步詳細的說明。
[0013] 圖1是用EST-SSR引物Ptssr0125對14個生理小種21個菌株的PCR擴增結(jié)果。 各泳道中，M代表分子量標(biāo)準(zhǔn)，1-21表示213個小麥葉銹菌株中的21個，其中11和12菌株 為THTS生理小種，2和19菌株為THTT生理小種，3,9,15和18菌株為THST生理小種，其它 泳道各代表一種生理小種。
【具體實施方式】
[0014] 用于鑒定小麥葉銹菌生理小種THTS的引物，是由序列表中引物Ptssr0125的上下 游核苷酸序列組成的引物對。
[0015] 應(yīng)用本引物序列鑒定小麥葉銹菌生理小種THTS的具體方法如下： 1、 提取待測小麥基因組DNA為模板； 2、 以Ptssr0125為引物、待測小麥葉銹菌基因組DNA為模板，進行PCR擴增。20 μL PCR 反應(yīng)體系為：模板DNA 60 ng，Taq酶0.5 U，上、下游引物（5 μ mol· Γ1)各0.4 μ L，dNTP (10 mmol ?ΟΟ. 4 yL，10 X PCR緩沖液2 yL，用無菌超純水補充反應(yīng)體系至20 yL; 反應(yīng)程序是94 °C預(yù)變性5min，隨后進行35個循環(huán)：94°C變性30 s，55°C退火30 s，72°C延 伸I min ;72°C延伸5 min，最后4°C保存。
[0016] 3、對擴增產(chǎn)物進行分離檢測：在擴增產(chǎn)物中加入非變性載樣指示劑，在濃度為 10% (w/v)的非變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳分離，銀染顯色，若擴增產(chǎn)物中含有200bp和 178bp大小的條帶，則待測小麥葉銹菌的致病類型為THTS。所述非變性載樣指示劑組成為： 0.25% (w/v)溴酚藍，0.25% (w/v)二甲苯腈和40% (w/v)蔗糖，溶劑為蒸餾水。
[0017] 下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法，所有引物合成均由華大基因 生物技術(shù)有限公司完成。
[0018] 實驗例： 小麥葉銹菌生理小種THTS，EST-SSR標(biāo)記Ptssr0125的獲得： 選用21對EST-SSR引物，所有引物序列源自Wang ei a乂 2010年開發(fā)的小麥葉銹菌 EST-SSR引物，以213個小麥葉銹菌菌株的基因組DNA為模板，進行PCR檢測，2〇μL PCR反 應(yīng)體系為：模板DNA 60 ng，Taq酶0.5 U，上、下游引物（5 μ mol· Γ1)各0.4 μ L，dNTP (10 mmol· 0 0.4 μ L，10 X PCR緩沖液2 μ L，用無菌超純水補充反應(yīng)體系至20 μ L。 PCR 反應(yīng)程序為：先 94 °C 5 min;然后 94 °C 30 s，55°C 30 s，72°C I min，共 35 個循環(huán)； 最后 72 °C 5 min，4°C保存。
[0019] 然后按下述方法對PCR擴增產(chǎn)物進行10% (w/v)的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢 測：取20 μL擴增產(chǎn)物，加入4 μ L非變性載樣指示劑（0.25% (w/v)溴酚藍，0.25% (w/v) 二甲苯腈和40% (w/v)蔗糖)，每份擴增樣品取3 yL在濃度為10%的非變性聚丙烯酰胺 凝膠中電泳分離， 銀染顯色。結(jié)果 14 個 EST-SSR 位點 Ptssr0083、Ptssr0019、Ptssr5649、Ptssr0085、 Ptssr2948、Ptssr0243、Ptssr0125、Ptssr5594、Ptssr0189、Ptssr0481、Ptssr0639、 Ptssr6542、Ptssr0182和Ptssr6386在213個菌株間有多態(tài)性，其中引物Ptssr0125檢測 出了兩種電泳帶型，分稱為帶型A和B，所有菌株均能擴增出200bp的DNA片段，見圖1中帶 型A，生理小種THTS還可擴增出178bp的DNA片段，見圖1中帶型B。
[0020] 實施例1 : 1、 提取213個葉銹菌株的基因組DNA為模板； 2、 以Ptssr0125為引物、213個葉銹菌基因組DNA為模板，進行PCR擴增。20 μL PCR反 應(yīng)體系為：模板 DNA 60 ng，Taq 酶 0.5 U，、下游引物（5 μ mol· Γ1)各 0.4 μ L，dNTP (10 mmol · 0 0.4 μ L，10 X PCR緩沖液2 μ L，用無菌超純水補充反應(yīng)體系至20 μ L。反 應(yīng)程序為：先 94 °C 5 min;然后 35 個循環(huán)：94 °C 30 s，55°C 30 s，72°C I min;最后 72 °C 5 min，4°C保存。
[0021] 3、對擴增產(chǎn)物進行分離檢測：在擴增產(chǎn)物中加入非變性載樣指示劑，然后在濃度 為10% (w/v)的變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳分離，銀染顯色，于聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測 的PCR擴增圖譜中，同時有200bp和178bp大小條帶的為生理小種THTS，只有200bp大小條 帶的為其它生理小種。
【主權(quán)項】
1. 一種用于鑒定小麥葉銹菌生理小種的引物序列，是由序列表中引物Ptssr0125的上 下游核苷酸序列組成的引物對。2. 權(quán)利要求1所述的引物序列在鑒定小麥葉銹菌生理小種中的應(yīng)用。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的引物序列在鑒定小麥葉銹菌生理小種中的應(yīng)用，其特征在 于：以待測小麥葉銹菌菌株基因組DNA為模板，以引物Ptssr0125進行PCR擴增，再對擴增 產(chǎn)物進行檢測；擴增產(chǎn)物含有200 bp條帶，且含有178 bp條帶時，則待測小麥葉銹菌的生 理小種類型為THTS。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的引物序列在鑒定小麥葉銹菌生理小種中的應(yīng)用，其特征在 于，所述的PCR擴增： 20ML PCR反應(yīng)體系為：模板DNA 60 ng，Taq酶0.5 U，上、下游引物（5 ii mol 各 0. 4 iiL，dNTP (IOmmol^r1)O. 4 iiL，10 X PCR 緩沖液 2 iiL，用無菌超純水補充反應(yīng) 體系至20 ii L ; PCR 反應(yīng)程序為：先 94 °C 5 min;然后 94 °C 30 s，55°C 30 s，72°C I min，共 35 個 循環(huán)；最后72 °C 5 min，4°C保存。5. 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的引物序列在鑒定小麥葉銹菌生理小種中的應(yīng)用，其特征 在于，所述的對擴增產(chǎn)物進行檢測是：對擴增產(chǎn)物在10% (w/v)的非變性聚丙烯酰胺凝膠 中電泳分離，銀染顯色。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于鑒定小麥葉銹菌生理小種THTS的引物應(yīng)用及THTS小種特異DNA序列，所述引物序列是由序列表中引物Ptssr0125的上下游核苷酸序列組成的引物對。利用該EST-SSR分子標(biāo)記可以對小麥葉銹菌進行快速的菌株生理小種鑒別。
【IPC分類】C12Q1/04, C12N15/11, C12Q1/68, C12R1/645
【公開號】CN104975073
【申請?zhí)枴緾N201410139689
【發(fā)明人】閆紅飛, 張林亞, 楊文香, 劉大群
【申請人】河北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開日】2015年10月14日
【申請日】2014年4月9日