專(zhuān)利名稱(chēng)：：一種小麥葉銹菌單克隆抗體及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物技術(shù)，特別是涉及一種小麥葉銹菌單克隆抗體及其制備方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：小麥銹病包括至文病菌包括小麥條銹菌(Pucciniastriiformisf.sp.tritici)、小麥口十誘菌(Pucciniatriticinaf.sp.tritic)禾口小麥禾干誘菌(Pucciciniagraminisf.sp.tritici)，是一類(lèi)世界性禾谷類(lèi)作物的重要病害。小麥銹病具有發(fā)生區(qū)域廣、暴發(fā)性強(qiáng)、流行頻率高、危害損失重等特點(diǎn)，嚴(yán)重威脅著我國(guó)小麥的生產(chǎn)安全，而在我國(guó)以小麥條銹病的發(fā)生最為廣泛，是影響我國(guó)小麥生產(chǎn)安全的首要病害，主要發(fā)生在西北、西南、長(zhǎng)江中下游和華北等有關(guān)省(市、自治區(qū))，每年發(fā)生面積約6000萬(wàn)畝，經(jīng)大力防治后仍年均減產(chǎn)小麥IO億公斤左右；其次是小麥葉銹病，在西南和長(zhǎng)江流域一帶發(fā)生最重，華北和東北地區(qū)每年也有較重危害，而小麥葉銹病中，小麥葉銹菌生理小種或致病類(lèi)型以K1T、THT兩個(gè)小種為主(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，蒲志剛，碩士論文"小麥葉銹菌群體毒性與DNA多態(tài)性關(guān)系分析及生理小種分子鑒定研究"2004)，；小麥稈銹病過(guò)去主要分布在東南沿海、長(zhǎng)江流域和福建、廣東、廣西的冬麥區(qū)及東北、內(nèi)蒙古等春麥區(qū)發(fā)生流行(李振岐和曾士邁，2000)，通過(guò)沿海地區(qū)病菌越冬菌源基地治理和洛夫林系統(tǒng)抗病品種的廣泛種植，近30年來(lái)基本控制了該病害的流行危害，但在西南、淮北和東北等局部地區(qū)每年仍有不同程度的發(fā)生。病害的早期診斷檢測(cè)是準(zhǔn)確測(cè)報(bào)和有效防控的基礎(chǔ)和前提。長(zhǎng)期以來(lái)，銹病的診斷主要基于病原菌的生物學(xué)及病害癥狀的特征，其預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)主要基于定期、大規(guī)模的田間病葉調(diào)查和室內(nèi)病菌小種的活體分離、培養(yǎng)和鑒定。而條銹病和葉銹病的苗期癥狀區(qū)別不甚明顯，一些基層植保人員常常將二者混淆；在小麥銹病潛育階段，寄主的發(fā)病癥狀不易觀(guān)察，難以界定初侵染的時(shí)期和規(guī)模。這些用于銹病診斷及病情測(cè)報(bào)的傳統(tǒng)方法不僅耗時(shí)費(fèi)工，且其準(zhǔn)確性和可靠度在很大程度上取決于調(diào)查測(cè)報(bào)人員的經(jīng)驗(yàn)積累與技術(shù)水平，難以滿(mǎn)足病害的快速、高通量診斷檢測(cè)實(shí)際需求。因此，有必要研發(fā)簡(jiǎn)單易行、靈敏準(zhǔn)確的小麥銹病快速診斷和檢測(cè)技術(shù)，其于鑒別病害、提高病害預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)的準(zhǔn)確度均具有重要的理論意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。目前，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所麥類(lèi)病害實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)針對(duì)這一生產(chǎn)中面臨的實(shí)際問(wèn)題，建立了小麥條銹菌和葉銹菌種的特異性分子診斷檢測(cè)技術(shù)(Caoetal.，2007;曹麗華等，2007)。然而，該類(lèi)基于PCR擴(kuò)增的病菌核酸檢測(cè)技術(shù)不但需要配置一些特殊儀器如PCR儀、凝膠電泳裝置等，且對(duì)操作人員的技術(shù)水平要求較高，難以在眾多基層植?？萍脊ぷ髡吆图夹g(shù)人員中推廣應(yīng)用。單克隆抗體技術(shù)，是由單細(xì)胞系列產(chǎn)生的同一種抗體蛋白，其僅與抗原分子中的一個(gè)抗原決定簇結(jié)合，故與抗原性物質(zhì)反應(yīng)時(shí)相對(duì)專(zhuān)一，不受其它物質(zhì)干擾，能區(qū)別物種間的細(xì)微差異。利用該方法檢測(cè)病原菌具有諸多優(yōu)點(diǎn)，如易于大量生產(chǎn)、可高通量檢測(cè)、免用標(biāo)記物，較易實(shí)現(xiàn)病菌的快速、實(shí)時(shí)、實(shí)地檢測(cè)(Wardetal.，2004;Werres&Steffens，1994)，促使其迅速在農(nóng)學(xué)、醫(yī)學(xué)和食品學(xué)中得到廣泛應(yīng)用。同時(shí)，該方法涉及的儀器化程度較低、操作簡(jiǎn)便，特別是對(duì)樣本前處理要求簡(jiǎn)單易于推廣，國(guó)際上許多權(quán)威機(jī)構(gòu)將其列為優(yōu)先發(fā)展的分析技術(shù)之一。因而，單克隆抗體技術(shù)是實(shí)現(xiàn)田間快速檢測(cè)病原菌的好方法(Danks&Barker，2000;Deweyetal.，1990;Wardetal.，2004)。自上世紀(jì)80年代以來(lái)，單克隆抗體技術(shù)已廣泛應(yīng)用于一些卵菌病原菌的生物學(xué)、分類(lèi)學(xué)及致病性方面的研究，諸如Phytophthoraci皿amomi(Hardhametal.，1986;Gaboretal.，1993)，Pythiumaphanidermat咖(Estrada-Garciaetal.，1989)，及Aphanomycesinvadans(Milesetal.，2003)，且成功石開(kāi)發(fā)了水生真菌Salmonellasp.，Escherichiacoli、Listeriamonocytoenes(Bokkenetal.，2003;Fratamicoetal.，1998;Koubovesetal.，2001;Leonardetal.，2004)及幾種細(xì)菌病原菌單克隆抗體檢測(cè)技術(shù)(Ipbaletal.，2000)。丹麥農(nóng)科院作為我們的合作伙伴，目前已經(jīng)在小麥條銹菌的單克隆抗體研究方面取得了一些進(jìn)展(Skottrupetal.，2007)，但其尚未對(duì)小麥葉銹菌的單克隆抗體制備方法進(jìn)行報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明針對(duì)小麥葉銹菌單克隆抗體檢測(cè)的空白現(xiàn)狀，提供一種小麥葉銹菌單克隆抗體及其制備方法與應(yīng)用，用于檢測(cè)小麥葉銹菌，具有特異性好、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便快速的優(yōu)點(diǎn)?！N小麥葉銹菌(Pucciniatriticinaf.sp.tritic)的單克隆抗體，其制備方法包括抗原免疫動(dòng)物、細(xì)胞融合制備雜交瘤細(xì)胞、雜交瘤細(xì)胞分泌單克隆抗體三個(gè)步驟，其特征在于所述抗原為小麥葉銹菌的夏孢子。所述抗原為小麥葉銹菌生理小種PHT和/或THT的夏孢子。所述抗原為小麥葉銹菌生理小種PHT的夏孢子和THT的夏孢子的等量混合物。所述抗原免疫動(dòng)物之前，先以弗氏佐劑乳化所述抗原。所述動(dòng)物為48周齡的Balb/C小鼠。上述單克隆抗體在檢測(cè)小麥葉銹病中的應(yīng)用。上述單克隆抗體的制備方法，步驟如下(1)以小麥葉銹菌小種PHT和/或THT的夏孢子為抗原免疫小鼠，篩選出能分泌出對(duì)小麥葉銹菌小種PHT和/或THT的夏孢子特異性反應(yīng)的血清的小鼠，(2)取小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，篩選陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞，(3)從陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)液上清中或陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞免疫小鼠制取的腹水中分離單克隆抗體?？剐←溔~銹菌raT、THT的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，其保藏號(hào)為CGMCCNo.3464。本發(fā)明目的是為檢測(cè)小麥葉銹病提供一種小麥葉銹菌單克隆抗體，其特點(diǎn)在于以完全的小麥葉銹菌夏孢子為抗原對(duì)動(dòng)物進(jìn)行免疫、制備雜交瘤細(xì)胞、從雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)液上清液中或雜交瘤細(xì)胞免疫小鼠抽取的腹水中分離純化而得到單克隆抗體。以葉銹菌夏孢子為抗原制得的該單克隆抗體專(zhuān)一識(shí)別小麥葉銹菌夏孢子(即幼苗期小麥攜帶的葉銹菌)，能夠鑒別小麥幼苗期麥苗的感染情況，使植保工作人員針對(duì)致病菌進(jìn)行提早防治。獲得該單克隆抗體后，植保工作人員通過(guò)目前常規(guī)的ELISA方法就可預(yù)測(cè)和鑒定小麥?zhǔn)欠窀?染小麥葉銹菌，與其他種類(lèi)致病菌的鑒定方法結(jié)合使用達(dá)到鑒別診斷的目的。根據(jù)本發(fā)明單克隆抗體的技術(shù)方案，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以采用不同的單一的或者混合的小麥葉銹菌生理小種的夏孢子作為抗原，制備得到專(zhuān)一針對(duì)某些生理小種的單克隆抗體。根據(jù)近些年來(lái)的文獻(xiàn)報(bào)道，大多數(shù)年份中，我國(guó)小麥葉銹菌中致病類(lèi)型以PHT、THT兩個(gè)生理小種為主，因此本發(fā)明具體提供一種采用小麥葉銹菌生理小種PHT和/或THT的夏孢子作為抗原制備得到的單克隆抗體，為鑒定檢測(cè)小麥葉銹病提供一種適應(yīng)性較廣泛的單克隆抗體。更進(jìn)一步地，本發(fā)明采用PHT和THT兩個(gè)生理小種夏孢子的等量混合物為抗原，制備的單克隆抗體能夠識(shí)別兩種專(zhuān)門(mén)識(shí)別兩種這兩種生理小種的感染情況，進(jìn)一步擴(kuò)大了單克隆抗體的鑒別檢測(cè)范圍。本發(fā)明中優(yōu)先采用弗氏佐劑對(duì)作為抗原的夏孢子或者夏孢子混合物進(jìn)行乳化，弗氏佐劑分為完全佐劑和不完全佐劑，可以增強(qiáng)夏孢子的免疫原性，提高制備抗體的效價(jià)。本發(fā)明還提供了一株雜交瘤細(xì)胞抗小麥葉銹菌raT、THT的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株LPT-l(保藏號(hào)為CGMCCNo.3464)。能夠產(chǎn)生高效價(jià)的本發(fā)明的單克隆抗體。本發(fā)明還提供了上述單克隆抗體的制備方法，操作步驟為制備單克隆抗體的常規(guī)技術(shù)，其特點(diǎn)在于采用小麥葉銹菌夏孢子為抗原，本可以技術(shù)人員可以根據(jù)本發(fā)明的制備方法制備得到本發(fā)明的單克隆抗體。抗小麥葉銹菌KIT、THT的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株LPT-l。分類(lèi)命名抗小麥葉銹菌KIT、THT的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株。保藏號(hào)CGMCCNo.3464。保藏日期2009年11月23日。保藏單位中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏地址北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)。具體實(shí)施方式實(shí)驗(yàn)材料小麥葉銹菌小種KIT、THT及其夏孢子，本實(shí)驗(yàn)室有保存，可向公眾發(fā)放。小麥品種鄭麥5389，本實(shí)驗(yàn)室有保存，可向公眾發(fā)放實(shí)施例1:小麥葉銹菌的擴(kuò)繁本發(fā)明根據(jù)目前中國(guó)小麥銹菌發(fā)生流行狀況，選擇小麥葉銹菌的主要流行小種raT、THT為實(shí)驗(yàn)材料，在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所的高溫室進(jìn)行鑒定與大量擴(kuò)繁。具體步驟如下1.種植小麥葉銹菌的感病品種鄭麥5389，等到第2片新葉長(zhǎng)出的時(shí)候，進(jìn)行K1T、THT的接種。2.接種前用裝有清水的小型噴壺把小麥葉片噴濕，操作人員的雙手經(jīng)酒精消毒后，蘸取清水輕輕抹去葉面的蠟紙層，手蘸葉銹菌夏孢子，涂抹在小麥葉片上，來(lái)回多抹幾次抹勻。3.抹過(guò)銹菌后，實(shí)驗(yàn)員的雙手先用70%的酒精沖洗，再用流動(dòng)的自來(lái)水沖洗干凈。4.然后輕輕的把接種好的小麥苗子放入接種用的預(yù)先沖洗干凈的鋁質(zhì)圓桶里，均勻的噴上水霧，看見(jiàn)有葉片表面有細(xì)霧即可，切忌噴水過(guò)多。5.加蓋塑料薄膜，黑暗條件下16t:下培養(yǎng)24小時(shí)。6.取出接種的小麥苗，室溫培養(yǎng)(2025tO，待接種后的小麥葉銹菌出現(xiàn)褪綠斑時(shí)，要剪去新葉，罩上已經(jīng)高溫滅菌的干凈玻璃罩。7.采集菌種時(shí)，把花盆放在臺(tái)子上，用手平托玻璃罩，用細(xì)的鐵條輕輕敲擊，使夏孢子落入罩內(nèi)，再敲擊罩子，使孢子粉在罩子內(nèi)呈一條線(xiàn)，傾倒入寫(xiě)好標(biāo)簽的小試管里。實(shí)施例2:小麥葉銹菌免疫小鼠1.收集新鮮擴(kuò)繁的2種小麥葉銹菌孢子，經(jīng)顯微鏡計(jì)數(shù)后，稱(chēng)量小麥葉銹菌PHT與THT夏孢子各0.15mg(5X105個(gè)孢子/ml)，加入675ii1生理鹽水與675iU弗氏完全佐劑(美國(guó)sigma公司，貨號(hào)F5881)，放入注射筒中，將2個(gè)注射筒接起來(lái)，來(lái)回推動(dòng)混勻得到乳化抗原。2.取48周齡雌性Balb/C小鼠，取200y1乳化抗原以皮下多點(diǎn)注射的方式進(jìn)行免疫。3周后，夏孢子懸液與弗氏不完全佐劑混合乳化，3周后，以弗氏不完全佐劑(美國(guó)sigma公司，貨號(hào)F5506)代替弗氏完全佐劑與菌液混合乳化，按照相同劑量及方式進(jìn)行免疫，后續(xù)免疫均按照此方案進(jìn)行。第3次加強(qiáng)免疫后，每次免疫后的第10天進(jìn)行小鼠眼下部位采血，采用間接ELISA法測(cè)定血清的效價(jià)與特異性。3.測(cè)定血清效價(jià)時(shí)，須預(yù)先準(zhǔn)備預(yù)包被有K1T、THT夏孢子的酶標(biāo)板孔，具體操作如下(1)將步驟1中的夏孢子懸液，以100iU每孔加入酶標(biāo)板孔，放置于37°。恒溫箱中孵育16h，取出后以PBS-T(含有0.05%的吐溫20)洗板3次，再向每孔加入200yl含有1%的脫脂奶粉的PBS于37t:封閉2h后儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?2)將梯度稀釋的抗血清100iU加入酶標(biāo)板孔，放置于37t:孵育lh，而后加入用PBS稀釋1000倍的羊抗鼠酶標(biāo)二抗，37t:孵育lh后取出洗板。(3)加入100ii1的單組份顯色底物(丹麥Kem-en-tec司，貨號(hào)4800H)，37。C孵育10min。(4)以0.2M的硫酸溶液中止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀測(cè)定450nm吸光度值。表1為其中一次的測(cè)定數(shù)據(jù)。表1血清效價(jià)測(cè)定結(jié)果示例<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>實(shí)施例3:小麥葉銹菌雜交瘤細(xì)胞株的篩選及單克隆抗體的制備取實(shí)施例2中血清效價(jià)較高的小鼠，以實(shí)施例2中的夏孢子懸液150ii1加強(qiáng)免疫，于5天后取小鼠脾臟與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合，"二步篩選法"篩選陽(yáng)性克隆，同時(shí)對(duì)于檢測(cè)出特異性抗體陽(yáng)性孔的細(xì)胞，及時(shí)地轉(zhuǎn)種并進(jìn)行克隆化。采用"有限稀釋法"進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞的克隆化，將細(xì)胞懸浮液連續(xù)稀釋至統(tǒng)計(jì)上每孔加樣僅含單個(gè)細(xì)胞，接種至培養(yǎng)板，就可由此單個(gè)細(xì)胞繁殖形成同源性的細(xì)胞克隆，有多孔陽(yáng)性時(shí)，盡可能取單克隆孔進(jìn)行再次克隆化，同時(shí)轉(zhuǎn)入24孔板，繼而轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，直至所有細(xì)胞孔的培養(yǎng)上清液均為陽(yáng)性。陽(yáng)性細(xì)胞株的篩選方法與實(shí)施例2中所述血清效價(jià)測(cè)定方法基本相同。唯一不同之處在于將實(shí)施例2中梯度稀釋的抗血清用陽(yáng)性細(xì)胞株的培養(yǎng)液上清進(jìn)行替換。將最終選得的陽(yáng)性細(xì)胞株(保藏號(hào)CGMCCNo.3464)，擴(kuò)大培養(yǎng)后，以體內(nèi)誘生法制備腹水。將制備的腹水中單克隆抗體經(jīng)鹽析沉淀后以蛋白A親和柱層析純化后備用。取與葉銹菌夏孢子同類(lèi)的條銹菌夏孢子、稈銹菌夏孢子等，分別制備按照實(shí)施2的方法包被酶標(biāo)板，用于包被的夏孢子的濃度為0.5mg/ml，將純化的單克隆抗體稀釋后加入酶標(biāo)板孔，進(jìn)行ELISA測(cè)定。根據(jù)吸光度值結(jié)果判定所篩選的單克隆抗體對(duì)這幾種孢子的交叉反應(yīng)。由表2可知，所制抗體對(duì)于K1T、THT兩種葉繡孢子0D值較高(0D>0.5)，其余均較低(0D<0.5)。說(shuō)明本發(fā)明制備的單克隆抗體是對(duì)PHT，THT的特異性抗體，可用于鑒別診斷小麥感染的是否是葉銹菌。表2所制備的單克隆抗體交叉反應(yīng)測(cè)定結(jié)果交叉反應(yīng)孢子類(lèi)型交叉反應(yīng)(以O(shè)D450mn值估算)葉繡PHT0.888THT1.511條銹SU140.419CY320.393稈繡21C30.37334C20.179注包被濃度為0.5mg/ml，其余條件同實(shí)施例2步驟3。實(shí)施例4:小麥葉銹菌特異性單克隆抗體在葉銹菌檢測(cè)中的應(yīng)用將實(shí)施例3中純化的單克隆抗體與包被好的酶標(biāo)板進(jìn)行ELISA測(cè)定，具體操作方法如下(1)稱(chēng)取葉銹菌孢子和待測(cè)的銹菌孢子樣品各0.3mg以實(shí)施例2的方法包被酶標(biāo)板，分別作為標(biāo)準(zhǔn)孔和對(duì)照孔。(2)在酶標(biāo)板孔中加入按最適合稀釋倍數(shù)稀釋好的單克隆抗體100iU，37t:避光反應(yīng)30min，PBS-T洗板4次，每次間隔30s，拍干;(3)加入用PBS稀釋1000倍的羊抗鼠酶標(biāo)二抗，37。C避光反應(yīng)30min，PBS-T洗板4次，每次間隔30s，拍干；(4)加入單組份顯色液(丹麥Kem-en-tec司，貨號(hào)4800H)100iU，37。C避光反應(yīng)30min;(5)加入0.2M的硫酸溶液100ii1終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀置450nm讀數(shù)。所有酶標(biāo)板加樣方式及反應(yīng)時(shí)間均一致。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)孔和對(duì)照孔的吸光度值確定未知樣品是否是葉銹菌孢子。檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3.7表3應(yīng)用單克隆抗體酶聯(lián)免疫檢測(cè)銹菌孢子結(jié)果示例<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>權(quán)利要求一種小麥葉銹菌(Pucciniatriticinaf.sp.tritic)的單克隆抗體，按以下步驟制得抗原免疫動(dòng)物、細(xì)胞融合制備雜交瘤細(xì)胞、雜交瘤細(xì)胞分泌單克隆抗體三個(gè)步驟，其特征在于所述抗原為小麥葉銹菌的夏孢子。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單克隆抗體，所述抗原為小麥葉銹菌生理小種PHT和/或THT的夏孢子。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的單克隆抗體，所述抗原為小麥葉銹菌生理小種PHT的夏孢子和THT的夏孢子等量混合物。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單克隆抗體，所述抗原免疫動(dòng)物之前，先以弗氏佐劑乳化所述抗原。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單克隆抗體，所述動(dòng)物為48周齡的Balb/C小鼠。6.權(quán)利要求15任一所述單克隆抗體在檢測(cè)小麥葉銹病中的應(yīng)用。7.權(quán)利要求1所述單克隆抗體的制備方法，步驟如下(1)以小麥葉銹菌小種PHT和/或THT的夏孢子為抗原免疫小鼠，篩選出能分泌出對(duì)小麥葉銹菌小種PHT和/或THT的夏孢子特異性反應(yīng)的血清的小鼠，(2)取小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，篩選陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞，(3)從陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)液上清中或陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞免疫小鼠制取的腹水中分離單克隆抗體。8.抗小麥葉銹菌raT、THT的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株LPT-1，其保藏號(hào)為CGMCCNo.3464。全文摘要本發(fā)明“一種小麥葉銹菌單克隆抗體及其制備方法與應(yīng)用”，屬于生物
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。本發(fā)明的單克隆抗體的制備方法包括抗原免疫動(dòng)物、細(xì)胞融合制備雜交瘤細(xì)胞、雜交瘤細(xì)胞分泌單克隆抗體三個(gè)步驟，其特征在于所述抗原為小麥葉銹菌的夏孢子。用于檢測(cè)小麥葉銹菌，具有特異性好、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便快速的優(yōu)點(diǎn)。文檔編號(hào)C07K16/14GK101709087SQ20091024155公開(kāi)日2010年5月19日申請(qǐng)日期2009年11月26日優(yōu)先權(quán)日2009年11月26日發(fā)明者劉太國(guó),陳萬(wàn)權(quán),高利申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所