用于檢測細菌性陰道病的試劑盒及其制備方法和檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及陰道疾病檢測技術(shù)領(lǐng)域，尤其設(shè)及一種用于檢測細菌性陰道病的試劑 盒，W及該種試劑盒的制備方法和使用該試劑盒檢測細菌性陰道病的方法。
【背景技術(shù)】
[000引細菌性陰道病化acteralvaginosis,BV)是育齡婦女常見的一種陰道感染性疾 病，是由于陰道正常菌群的生態(tài)平衡發(fā)生素亂，優(yōu)勢菌群乳酸桿菌減少或消失，而陰道加特 納菌、厭氧菌、彎曲弧菌等微生物過度生長所致的無陰道粘膜炎性改變的混合感染。BV可導(dǎo) 致組織性絨毛膜炎、羊水感染、剖腹手術(shù)后子宮內(nèi)膜炎及其他妊娠不良和妊娠并發(fā)癥，并與 婦科常見疾病如輸卵管炎、盆腔炎、宮外孕、不孕癥、泌尿系統(tǒng)感染、術(shù)后感染及婦科腫瘤密 切相關(guān)。
[000引 目前臨床診斷BV的標準是Amsel法，下列4項中有S項陽性，即可臨床診斷為細 菌性陰道病。（1)均質(zhì)、稀薄、白色陰道分泌物，常粘附于陰道壁；（2)線索細胞（cluecell) 陽性；0)陰道分泌物抑> 4. 5 ; (4)胺臭味實驗（whifftest)陽性。Amsel法為基本的 臨床診斷方法，該方法成本低廉，但實際應(yīng)用中受很多因素的影響，在臨床準確實施并非易 事。觀察陰道分泌物時常受到主觀因素的干擾，尤其合并其他種類的陰道炎癥時陰道分泌 物不典型，白帶性狀的判定常給臨床醫(yī)生帶來困惑。作為BV診斷最佳指標的線索細胞的識 別則受到顯微設(shè)備的質(zhì)量、樣本的采集W及操作者的經(jīng)驗等諸多因素的共同影響。也有觀 點認為其仍不能提供最準確的診斷，原因在于碎片及退化的細胞有時會被誤認為是線索細 胞。抑值測定與胺實驗敏感但不特異，近期性交、陰道灌洗、處于月經(jīng)期及陰道分泌物中混 有大量宮頸粘液等，可導(dǎo)致抑值升高或使分泌物產(chǎn)生異味。Amsel法結(jié)果判斷客觀性、重復(fù) 性不好，易受到主觀影響，可能漏診、誤診。（"重復(fù)性不好"針對的是不同的醫(yī)生因為經(jīng)驗 技術(shù)的不同，檢測的結(jié)果可能不一樣。金標準的準確實施需要臨床醫(yī)生充足的經(jīng)驗，目前臨 床實施金標準普遍只用單項的指標，如只做胺實驗，或只看線索細胞。）
[0004]除Amsel法臨床診斷標準外，還可W根據(jù)陰道分泌物涂片的Nugent革蘭氏染色評 分對BV進行診斷。評分為乳桿菌分值、陰道加德納菌和類桿菌分值、染色不定彎曲小桿菌 分值之和，按每10個油鏡視野所觀察到的每種細菌的平均數(shù)量進行計算和分值分配。分 值范圍為0-10,BV的診斷標準為>7分，分值在4-6分為臨界范圍，分值在0-3為正常。 Nugent法客觀性、重復(fù)性好，但對技術(shù)人員要求較高，操作步驟復(fù)雜，需要經(jīng)過涂片、革蘭氏 染色、高倍鏡下計數(shù)、分值計算等步驟，耗時間較長、臨床不易推廣。且易受標本的采集、檢 驗師的經(jīng)驗、染色差異及涂片的均勻度等多方面影響。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明針對現(xiàn)有的細菌性陰道病檢測方法存在判斷主觀性大，結(jié)果重復(fù)性不好， 或?qū)z測技術(shù)人員要求高、檢測步驟復(fù)雜的問題，提供一種用于檢測細菌性陰道病的試劑 盒，W及該種試劑盒的制備方法和使用該試劑盒檢測細菌性陰道病的方法。應(yīng)用該試劑盒 檢測細菌性陰道病的客觀性和重復(fù)性好且檢測步驟簡單、檢測結(jié)果準確。
[0006] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用W下技術(shù)方案。
[0007] 一種用于檢測細菌性陰道病的試劑盒，包括反應(yīng)液和顯色劑，所述反應(yīng)液由 0. 2-0. 3g/L的5-漠-4-氯-3-嘲噪基a-D-N-己酷神經(jīng)氨酸鹽、0. 2-0. 3g/L的對哲基苯 甲酸己醋鋼和復(fù)合緩沖液組成；所述顯色劑由0. 45-0. 55mg/L的4-氨基安替比林（4-AAP) 和緩沖液組成。
[000引優(yōu)選的，所述反應(yīng)液由0. 25g/L的5-漠-4-氯-3-嘲噪基a-D-N-己酷神經(jīng)氨酸 鹽、0. 25g/L的對哲基苯甲酸己醋鋼和復(fù)合緩沖液組成。
[0009] 優(yōu)選的，所述顯色劑由0. 5mg/L的4-氨基安替比林（4-AA巧和緩沖液組成。
[0010] 優(yōu)選的，反應(yīng)液中的復(fù)合緩沖液由抑=7. 2的磯酸鹽緩沖液與抑=5. 0的己酸 鋼緩沖液等體積混合組成。
[0011] 優(yōu)選的，顯色劑中的緩沖液為抑=7. 2的磯酸鹽緩沖液。
[0012] W上所述用于檢測細菌性陰道病的試劑盒的制備方法，包括W下步驟：
[0013] S1制備反應(yīng)液；向復(fù)合緩沖液中加入對哲基苯甲酸己醋鋼并攬拌均勻，得混合 液；靜置混合液30min，接著再在攬拌的條件下向混合液中加入5-漠-4-氯-3-嘲噪基 曰-D-N-己酷神經(jīng)氨酸鹽，5-漠-4-氯-3-嘲噪基a-D-N-己酷神經(jīng)氨酸鹽完全溶解后，制 得反應(yīng)液。
[0014] 復(fù)合緩沖液的配制；將抑=7. 2的磯酸鹽緩沖液與抑=5. 0的己酸鋼緩沖液等 體積混合，形成復(fù)合緩沖液。
[0015] S2制備顯色劑；向緩沖溶中加入4-AAP，攬拌均勻，制得顯色劑。優(yōu)選的，所述緩沖 液為抑=7. 2的磯酸鹽緩沖液。
[0016] 應(yīng)用W上所述試劑盒的細菌性陰道病的檢測方法，包括W下步驟：將待測樣本 洗脫至反應(yīng)液中并使待測樣本在反應(yīng)液中分散，得待測液；將待測液置于37+rc中靜置 lOmin;接著向待測液中加入顯色劑，觀察待測液的顏色；若待測液的顏色為黃色，檢測結(jié) 果為陰性；若待測液的顏色為綠色至藍色，檢測結(jié)果為陽性（待測液的顏色越深，說明唾液 酸巧酶的活性越高）。
[0017] 優(yōu)選的，檢測方法中使用的反應(yīng)液與顯色劑的體積比為10:3。
[0018] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明的反應(yīng)液W5-漠-4-氯-3-嘲噪 基a-D-N-己酷神經(jīng)氨酸鹽為反應(yīng)底物，反應(yīng)底物與待測樣本中的唾液酸巧酶作用，使唾 液酸巧酶分解并釋放出漠嘲噪基，漠嘲噪基與顯色劑作用后，待測液顏色會發(fā)生變化，從而 可根據(jù)待測液的顏色直接判斷檢測結(jié)果。在反應(yīng)液中加入對哲基苯甲酸己醋鋼，不僅可防 止真菌的生長，還可使反應(yīng)底物與唾液酸巧酶進行更充分的反應(yīng)，提高檢測的靈敏度和特 異性。反應(yīng)液中使用復(fù)合緩沖液，復(fù)合緩沖液由抑=7. 2的磯酸鹽緩沖液與抑=5. 0的己 酸鋼緩沖液等體積混合組成，可進一步提高檢測的靈敏度和特異性，并可縮短檢測所需時 間，待測液只需置于37±rC中l(wèi)Omin即可進行顯色反應(yīng)，提高檢測效率。應(yīng)用本發(fā)明提供 的試劑盒檢測細菌性陰道病，具有簡單、快速、靈敏度高和特異性好的特點，并且性價比高， 適用于臨床快速檢測。
【具體實施方式】
[0019] 為了更充分理解本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容，下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案作 進一步介紹和說明。
[0020] 實施例
[0021] 本實施例提供一種用于檢測細菌性陰道病的試劑盒和試劑盒的制備方法，W及使 用該試劑盒檢測細菌性陰道病的檢測方法。
[002引1、0. 02mol/L的磯酸鹽緩沖液加=7.2)的制備；
[0023]選用分析純級磯酸二氨鋼（化畔〇4? 2&0)和磯酸氨二鋼（化2冊〇4? 12&0)，用分 析天平分別稱取4.Og磯酸二氨鋼和4. 5g磯酸氨二鋼，將磯酸二氨鋼和磯酸氨二鋼溶解 于lOOOmL的純化水中，攬拌至磯酸二氨鋼和磯酸氨二鋼完全溶解，然后用純化水補充至 2000mL，制得抑=7. 2的磯酸鹽緩沖液。按該方法制備充足的磯酸鹽緩沖液（pH= 7. 2)， 備用。
[0024] 2、0. 02mol/L的己酸鋼緩沖液（pH= 5. 0)的制備；
[0025] 選用分析純級無水己酸鋼，用分析天平稱取3. 3g無水己酸鋼，將無水己酸鋼溶解 于lOOOmL的純化水中，攬拌至無水己酸鋼完全溶解，然后用純化水補充至2000mU接著用 冰醋酸調(diào)節(jié)溶液的抑至5. 0,制得抑=5. 0的己酸鋼緩沖液。按該方法制備充足的己酸鋼 緩沖濃（pH= 5. 0),備用。
[0026] 3、反應(yīng)液的制備
[0027] 將2000血，0. 02mol/L的磯酸鹽緩沖液（pH= 7.。與2000血，0. 02mol/L的己酸 鋼緩沖液（pH= 5. 0)等體積混合，形成復(fù)合緩沖液。
[002引向復(fù)合緩沖液中加入l.Og對哲基苯甲酸己醋鋼，攬拌至對哲基苯甲酸己醋鋼完 全溶解，得混合液。
[0029] 靜置混合液30min，接著再在攬拌的條件下向混合液中加入1.Og的 5-漠-4-氯-3-嘲噪基a-D-N-己酷神經(jīng)氨酸鹽，攬拌至5-漠-4-氯-3-嘲噪基a-D-N-己 酷神經(jīng)氨酸鹽完全溶解后，制得反應(yīng)液。
[0030] 分裝反應(yīng)液，常溫儲存?zhèn)溆谩?br>[0031] 在其它實施方案中，還可配置5-漠-4-氯-3-嘲噪基a-D-N-己酷神經(jīng)氨酸鹽的 濃度為0. 2-0. 3g/l，對哲基苯甲酸己醋鋼的濃度為0. 2-0. 3g/L的反應(yīng)液。
[003引 3、顯色劑的制備
[0033] 用分析天平稱取0.5mg的4-AAP純品，將4-AAP溶解于lOOOmL，0.02mol/L的磯酸 鹽緩沖液（pH= 7. 2)中，制得4-AAP的濃度為0. 50mg/L的顯色劑。
[0034] 分裝顯色劑，常溫儲存?zhèn)溆谩?br>[0035] 在其它實施方案中，還可W配置4-AAP的濃度為0.45-0. 55mg/L的顯色劑。
[0036] 由反應(yīng)液和顯色劑組成用于檢測細菌性陰道病的試劑盒。
[0037] 4、使用試劑盒檢測細菌性陰道病
[003引將待測樣本洗脫至500yL的反應(yīng)液中并使待測樣本在反應(yīng)液中分散，得待測液； 將待測液置于37+rC中靜置lOmin;接著向待測液中加入150yL的顯色劑。在3min內(nèi)觀 察待測液的顏色；若待測液的顏色為黃色，檢測結(jié)果為BV陰性；若待測液的顏色為綠色至 藍色，檢測結(jié)果為BV陽性（待測液的顏色越深，說明唾液酸巧酶的活性越高）。
[0039]實驗1;靈敏度實驗
[0040] 試驗方法；使用上述實施例中的用于檢測細菌性陰道病的試劑盒（唾液酸巧酶 法），分別檢測濃度為OU/mL、抓/mL、抓/mL、7U/mL、8U/mL、9U/mL的唾液酸巧酶溶液，根據(jù)試 劑盒對系列濃度的唾液酸巧酶溶液的檢測結(jié)果來確定試劑盒的靈敏度。
[0041] 具體步驟：
[0042] (1)系列濃度唾液酸巧酶溶液的配制；取唾液酸巧酶凍干品（sigma)，用0.02mol/ LpH7. 3磯酸鹽-50%甘油-5%BSA緩沖液將唾液酸巧酶凍干品稀釋，制備成濃度分別為 0U/20UL、抓/20uL、抓/20uL、7U/20uL、8U/20uL、9U/20uL的唾液酸巧酶原液。
[0043] (2)取6支反應(yīng)管（每支反應(yīng)管中含反應(yīng)液490uL)，打開反應(yīng)管蓋，向6支反應(yīng)管 中對應(yīng)加入lOuL濃度為 0U/20UL、抓/20uL、抓/20uL、7U/20uL、8U/20uL、9U/20uL的唾液酸 巧酶原液，6支反應(yīng)管中唾液酸巧酶的濃度分別是OU/