Pcsk9拮抗劑的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及單克隆技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種PCSK9拮抗劑。
【背景技術(shù)】
[0002] 蛋白原轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素-可新9型（proproteinconvertase subtilisin-kexintype9)(下文稱(chēng)為"PCSK9"），又名神經(jīng)凋亡調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化酶1( "NARC-1"）， 是一種蛋白酶K樣枯草桿菌酶，經(jīng)鑒定為分泌型枯草桿菌酶家族的第9個(gè)成員；（Seidah 等，2003PNAS100 :928-933)。編碼PCSK9 的基因定位在人染色體Ip33-p34. 3;Seidah 等，見(jiàn)上文。PCSK9在能夠增殖和分化的細(xì)胞中表達(dá)，包括例如肝細(xì)胞、腎間質(zhì)細(xì)胞、回 腸（intestinalileum)和結(jié)腸上皮以及胚胎端腦神經(jīng)元（Seidah等，2003PNAS100: 928-933)。
[0003]PCSK9在肝細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞的分化中發(fā)揮作用（Seidah等，2003PNAS100: 928-933)，在胚胎肝臟中高表達(dá)，并且與膽固醇體內(nèi)平衡強(qiáng)烈相關(guān)。最近的研究似乎暗示 了其在膽固醇生物合成或攝取中的特定作用。在飼喂膽固醇的大鼠的研究中，Maxwell等 發(fā)現(xiàn)，PCSK9以類(lèi)似于牽涉膽固醇生物合成的三個(gè)其他基因的方式被下調(diào)（Maxwell等， 2003J.LipidRes. 44 :2109-2119)。有趣的是，和牽涉膽固醇代謝的其它基因一樣，PCSK9的 表達(dá)也受留醇調(diào)控元件-結(jié)合蛋白（"SREBP"）的調(diào)控（Maxwell等，2003J.LipidRes. 44: 2109-2119)。后來(lái)研究證明此類(lèi)調(diào)控在參與脂蛋白代謝的其它基因中非常典型（Dubuc等， 2004Arterioscler.Thromb.Vase.Biol. 24 :1454-1459)。PCSK9 的表達(dá)被他汀類(lèi)（statins) 上調(diào)，這是由于這些藥物的降膽固醇效應(yīng)。此外，PCSK9啟動(dòng)子有兩個(gè)涉及膽固醇調(diào)控的保 守性位點(diǎn)、留醇調(diào)控元件和Spl位點(diǎn)；見(jiàn)上文。PCSK9的腺病毒表達(dá)已顯示可導(dǎo)致循環(huán)LDL 顯著的時(shí)間依賴(lài)性增加（Benjannet等，2004J.Biol.Chem. 279 :48865-48875)。此外，刪 除PCSK9基因的小鼠肝LDL受體水平增加，LDL從血漿中清除更快；Rashid等，2005Proc. Natl.Acad.Sci.USA102 :5374-5379。最近據(jù)報(bào)道，將用PCSK9瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的H印G2細(xì)胞的培 養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到未轉(zhuǎn)染的H印G2細(xì)胞時(shí)，減少細(xì)胞表面LDLR的數(shù)量和LDL的內(nèi)化；參見(jiàn)Cameron 等，2006HumanMol.Genet. 15 :1551-1558。結(jié)論是PCSK9或者經(jīng)PCSK9作用的因子被分泌并 能夠降解轉(zhuǎn)染的和未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中的LDLR。更近來(lái)，據(jù)證實(shí)，加到H印G2細(xì)胞培養(yǎng)基中的純 化PCSK9具有以劑量和時(shí)間依賴(lài)性方式減少細(xì)胞表面LDLR數(shù)目的作用（Lagace等，2006J. Clin.Invest. 116 :2995-3005)。
[0004]PCSK9基因中的很多突變已確定與以下病癥相關(guān)：常染色體顯性高膽固醇血癥 ("ADH"）、以血漿中低密度脂蛋白（"LDL"）顆粒顯著升高為特征的遺傳性代謝紊亂（可 導(dǎo)致早發(fā)性心血管衰竭）；（Abifadel等，2003NatureGenetics34 :154-156；Timms等， 2004Hum.Genet. 114 :349-353 ;Leren，2004Clin.Genet. 65 :419-422)。后來(lái)Abifadel等發(fā) 表的對(duì)S127R突變的研究報(bào)道，攜帶這種突變的患者血漿中總膽固醇和apoBlOO較高，原因 是⑴含有apoBlOO的脂蛋白例如低密度脂蛋白（"LDL")、極低密度脂蛋白（"VLDL"）和 中密度脂蛋白（"IDL"）的過(guò)量產(chǎn)生，和（2)所述脂蛋白清除或轉(zhuǎn)化的相關(guān)減少。
[0005] 綜合起來(lái)，上述研究證實(shí)了PCSK9在調(diào)控LDL產(chǎn)生中起作用的事實(shí)。PCSK9的表達(dá) 或上調(diào)與增加的LDL膽固醇的血漿水平有關(guān)，PCSK9表達(dá)的抑制或缺乏與LDL膽固醇血漿 水平低有關(guān)。值得注目的是，與PCSK9序列變化相關(guān)的較低水平的LDL膽固醇可提供針對(duì) 冠心病的保護(hù)（Cohen，2006N.Engl.J.Med. 354 :1264-1272)。臨床試驗(yàn)已證明LDL膽固醇含 量減少與冠狀動(dòng)脈（coronary)事件率直接相關(guān)（Law等，2003BMJ326:1423-1427)。此外， 最近已證明，血漿LDL膽固醇含量終生中度減少與冠狀動(dòng)脈事件的發(fā)生率大幅減少顯著相 關(guān)；甚至在非脂質(zhì)相關(guān)心血管風(fēng)險(xiǎn)因子高度盛行（prevalence)的群體中也是如此。因此， 對(duì)LDL膽固醇含量進(jìn)行管理控制大有裨益。
[0006] 因此，制備抑制或拮抗PCSK9活性和PCSK9在各種治療狀況下所發(fā)揮的相應(yīng)作用 的、基于治療的PCSK9拮抗劑非常重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供PCSK9拮抗劑、藥物組合物及其用途。
[0008] 本發(fā)明涉及PCSK9拮抗劑，特別是人PCSK9拮抗劑。PCSK9的蛋白特異性拮抗劑 (或本文稱(chēng)為"PCSK9特異性拮抗劑"）是有效抑制PCSK9功能的PCSK9蛋白特異性結(jié)合分 子或蛋白，它們?cè)谥委熍cPCSK9功能相關(guān)或受PCSK9功能影響的病癥中非常重要，所述病癥 包括但不限于高膽固醇血癥、冠心病、代謝綜合征、急性冠狀動(dòng)脈綜合征和相關(guān)病癥。PCSK9 特異性拮抗劑的特征在于，對(duì)PCSK9的選擇性識(shí)別和結(jié)合。PCSK9特異性拮抗劑不顯示對(duì) 除PCSK9之外的物質(zhì)的顯著結(jié)合，除了在那些特殊情況下：使拮抗劑補(bǔ)充帶有另外的、與 PCSK9特異性結(jié)合部分不同的特異性。在【具體實(shí)施方式】中，PCSK9特異性拮抗劑與人PCSK9 結(jié)合的KD為1. 2X10-6或更少。在【具體實(shí)施方式】中，PCSK9特異性拮抗劑與人PCSK9結(jié)合的 KD為1X10-7或更少。在另外的實(shí)施方式中，PCSK9特異性拮抗劑與人PCSK9結(jié)合的KD為 1X10-8或更少。在其它實(shí)施方式中，PCSK9特異性拮抗劑與人PCSK9結(jié)合的KD為5X10-9 或更少，或1X10-9或更少。其他實(shí)施方式中，PCSK9特異性拮抗劑與人PCSK9結(jié)合的KD為 1X10-10或更少，1X10-11或更少，或1X10-12或更少。在【具體實(shí)施方式】中，PCSK9特異性拮 抗劑不以上述水平結(jié)合其它蛋白。
[0009] PCSK9特異性拮抗劑有效抵抗對(duì)細(xì)胞LDL攝取的PCSK9依賴(lài)性抑制。已屢次證明， PCSK9特異性拮抗劑對(duì)PCSK9對(duì)LDL攝取的影響呈劑量依賴(lài)性抑制。因此，PCSK9特異性拮 抗劑對(duì)降低血漿LDL膽固醇水平非常重要。所述拮抗劑還可在檢測(cè)和定量PCSK9中用于各 種診斷目的。
[0010] 在【具體實(shí)施方式】中，本發(fā)明包括PCSK9特異性拮抗劑，以及，在【具體實(shí)施方式】中， 本發(fā)明包括抗體分子，所述抗體分子包含公開(kāi)的重鏈和/或輕鏈可變區(qū)、具有一個(gè)或多 個(gè)保守性氨基酸取代的等同物和它們的同源物（homologs)?！揪唧w實(shí)施方式】包括分離的 PCSK9特異性拮抗劑，所述拮抗劑含有公開(kāi)的CDR結(jié)構(gòu)域或重鏈和/或輕鏈CDR結(jié)構(gòu)域 的組（sets)以及它們的以具有一個(gè)或多個(gè)保守性氨基酸取代為特征的等同物。本領(lǐng)域 技術(shù)人員將理解，可將保留了拮抗PCSK9能力的PCSK9特異性拮抗劑片段插入各種構(gòu)架 (frameworks)中，參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利6, 818, 418以及其中的參考文獻(xiàn)，它們討論了可用于 展示抗體環(huán)的各種支架（scaffolds),所述抗體環(huán)之前基于抗原結(jié)合來(lái)選擇。另選方案中， 可使用重組方法摻入編碼VL和VH的基因，例如使用可使VL和VH成為單一蛋白鏈（或者 稱(chēng)為單鏈Fvs( "ScFVs"））的合成接頭，在該單一蛋白鏈中VL和VH區(qū)域配對(duì)形成單價(jià)分 子；參見(jiàn)例如，Bird等，1988,Science242 :423_426,以及Huston等，1988Proc.Natl.Acad. Sci.USA85 :5879-5883。
[0011]PCSK9特異性拮抗劑和片段可以是各種非基于抗體的支架的形式，包括 但不限于高親和性多聚體（avimers)(Avidia) ;DARPins(MolecularPartners);Adnectins(Adnexus)，Anticalins(Pieris)和Affibodies(Affibody)?？茖W(xué)文獻(xiàn)中對(duì)用于 蛋白結(jié)合的可選支架的使用進(jìn)行了很多評(píng)價(jià)，參見(jiàn)例如Binz&Pliickthun，2005Curr.Opin. Biotech. 16 因此，具有PCSK9選擇性的、可抵抗對(duì)細(xì)胞LDL攝取的PCSK9依賴(lài)性抑 制、非基于抗體的支架或拮抗劑分子構(gòu)成了本發(fā)明的重要實(shí)施方式。
[0012] 另一方面，本發(fā)明提供編碼公開(kāi)的PCSK9特異性拮抗劑的核酸。在具體方面，本發(fā) 明提供編碼PCSK9特異性拮抗劑的核酸，在【具體實(shí)施方式】中提供了編碼本文公開(kāi)的抗體分 子的核酸，所述抗體分子包含本文公開(kāi)的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)以及它們的選擇組分， 尤其是公開(kāi)的各自的CDR3區(qū)域。另一方面，本發(fā)明提供包含所述核酸的載體。另一方面， 本發(fā)明提供包含編碼公開(kāi)的PCSK9特異性拮抗劑（在特定實(shí)施方式中是所述公開(kāi)的抗體分 子和它們的組分）的核酸的分離的細(xì)胞。另一方面，本發(fā)明提供包含本發(fā)明多肽或載體的 分離的細(xì)胞。
[0013] 另一方面，本發(fā)明提供制備選擇性結(jié)合PCSK9的PCSK9特異性拮抗劑的方法，所述 PCSK9特異性拮抗劑包括抗體、抗原結(jié)合片段、衍生物、嵌合分子、上述任何物質(zhì)與另一種多 肽的融合物、或能夠特異性結(jié)合PCSK9的可選結(jié)構(gòu)/組成（compositions)。該方法包括在 允許PCSK9特異性拮抗劑表達(dá)和/或裝配（assembly)的條件下培養(yǎng)細(xì)胞并從細(xì)胞中分離 所述拮抗劑，所述細(xì)胞包含編碼PCSK9特異性拮抗劑的核酸，或包含編碼它們的一個(gè)或多 個(gè)組分的獨(dú)立的核酸，其中當(dāng)所述核酸表達(dá)時(shí)，合起來(lái)（collectively)產(chǎn)生所述措抗劑。
[0014] 本領(lǐng)域技術(shù)人員還可用標(biāo)準(zhǔn)的重組DNA技術(shù)獲得本文公開(kāi)的PCSK9特異性拮抗 劑。
[0015] 另一方面，本發(fā)明提供拮抗PCSK9活性或功能、或PCSK9的已注意到的作用 (notedeffect)的方法，該方法包括使表達(dá)PCSK9(或用PCSK9處理）的感興趣的細(xì)胞、細(xì)胞 群體或組織樣品與本文公開(kāi)的PCSK9特異性拮抗劑在允許所述拮抗劑結(jié)合PCSK9的條件下 接觸。
[0016] 本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】包括這樣的方法：其中所述細(xì)胞是人細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的 拮抗劑有效抑制PCSK9功能。發(fā)現(xiàn)本文公開(kāi)的PCSK9特異性拮抗劑劑量依賴(lài)性抑制PCSK9 對(duì)LDL攝取的影響。
[0017] 另一方面，本發(fā)明提供在對(duì)象中拮抗PCSK9活性的方法，所述對(duì)象表現(xiàn)與 PCSK9活性相關(guān)的病癥或其中對(duì)特定對(duì)象而言PCSK9起作用（functioning)是禁忌 (contraindicated)的病癥，所述方法包括給予所述對(duì)象治療有效量的本發(fā)明PCSK9特異 性拮抗劑。在選擇實(shí)施方式中，所述病癥可以是高膽固醇血癥、冠心病、代謝綜合征、急性冠 狀動(dòng)脈綜合征或相關(guān)病癥。另一方面，本發(fā)明提供藥物組合物或其它組合物，其包含本發(fā)明 PCSK9特異性拮抗劑和藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑、稀釋劑、穩(wěn)定劑、緩沖劑或設(shè)計(jì)用來(lái)便 于將所需量的拮抗劑給予治療個(gè)體的另選物質(zhì)（alternative)。
[0018] 本發(fā)明還涉及在細(xì)胞樣品中鑒定PCSK9拮抗劑的方法，其包括向細(xì)胞樣品提供純 化的PCSK9和標(biāo)記的LDL顆粒；向該細(xì)胞樣品提供懷疑是PCSK9拮抗劑的分子；培養(yǎng)該細(xì)胞 樣品一段時(shí)間，所述時(shí)間足以允許細(xì)胞攝取LDL顆粒；通過(guò)除去上清液來(lái)分離細(xì)胞樣品中 的細(xì)胞；減少（reducing)標(biāo)記的LDL顆粒的非特異性結(jié)合；裂解細(xì)胞；定量細(xì)胞裂解物中 保留的標(biāo)記物的量；以及鑒定導(dǎo)致定量的標(biāo)記物的量相比于單獨(dú)給予PCSK9時(shí)觀察到的標(biāo) 記物的量有所增加的那些候選拮抗劑。導(dǎo)致定量的標(biāo)記物的量增加的候選拮抗劑是PCSK9 拮抗劑。已證明該方法是用于鑒定PCSK9特異性拮抗劑的有效手段，因此形成了本發(fā)明的 重要方面。
[0019] 下表提供了本發(fā)明中所討論的序列的概覽


【附圖說(shuō)明】
[0022] 圖1說(shuō)明抗體表達(dá)載體pV73;
[0023] 圖2說(shuō)明外極性（Exopolar)PCSK9突變體的效力如何與血漿LDL-膽固醇相關(guān)；
[0024] 圖3抗體分子F16-15劑量依賴(lài)性抑制PCSK9對(duì)LDL攝取的影響；
[0025] 圖4抗體分子F16-15的IC-50的計(jì)算
[0026] 圖51CX1G08顯示對(duì)細(xì)胞LDL攝取的PCSK9依賴(lài)性抑制；
[0027] 圖6F16-15當(dāng)被注射至小鼠時(shí)對(duì)血清膽固醇的作用；
[0028] 圖7F16-15當(dāng)被注射至小鼠時(shí)對(duì)血清膽固醇的時(shí)間進(jìn)程試驗(yàn)。
【具體實(shí)施方式】
[0029] 本發(fā)明涉及PCSK9拮抗劑，特別是人PCSK9拮抗劑。根據(jù)本發(fā)明的PCSK9的蛋白 特異性拮抗劑（或"PCSK9特異性拮抗劑"）有效抑制PCSK9的功能，從而在治療與PCSK9 功能相關(guān)/受PCSK9功能影響的病癥中非常重要，所述病癥包括但不限于高膽固醇血癥、冠 心病、代謝綜合征、急性冠狀動(dòng)脈綜合征和相關(guān)病癥