二 醇、丙二醇或聚乙二醇。
[0073] 優(yōu)選地，藥物組合物的形式是胃腸外可接受的水溶液，其無熱原，具有合適的pH、
[0074] 張力和穩(wěn)定性。藥物組合物可配制成用于在等滲載體中稀釋之后給藥，所述等滲 載體例如為氯化鈉注射液、林格氏（Ringer's)注射液或乳酸鹽（Lactated)林格氏注射液。 [0075]拮抗劑治療的劑量給藥（dosing)在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)，參見 例如Lederman等，1991Int.J.Cancer47 :659-664 ;Bagshawe等，1991Antibody， Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals4 :915_922,并基于很多因素而變化，所述 因素包括但不限于所用的具體PCSK9特異性拮抗劑、治療的患者、患者狀況、治療的面積、 給藥途徑和所需的治療。具有一般技能的醫(yī)師或獸醫(yī)能夠容易地確定拮抗劑的治療有效量 并開具處方。劑量范圍可以是主體體重的約〇.〇l-l〇〇mg/kg，更通常為0. 05-25mg/kg。例 如，劑量可以是〇? 3mg/kg體重、lmg/kg體重、3mg/kg體重、5mg/kg體重或10mg/kg體重或 在l-10mg/kg體重范圍內(nèi)。出于說明而非限制的目的，在【具體實施方式】中，可使用5mg-2. Og 的劑量全身遞送拮抗劑。實現(xiàn)最精確地使拮抗劑濃度在產(chǎn)生效力但無毒性的范圍內(nèi)，需要 有基于藥物對于靶位點的可用性的動力學的給藥方案。這涉及考慮PCSK9特異性拮抗劑的 分布、平衡和消除。本文所述的拮抗劑可以合適的劑量單獨使用。或者，與其他物質(zhì)共同給 藥或順序給藥可能是合意的。有可能提供供本發(fā)明PCSK9特異性拮抗劑和可選治療方案聯(lián) 用的治療劑量方案。例如，PCSK9特異性拮抗劑可與其它降膽固醇藥（包括但不限于膽固 醇吸收抑制劑（例如ZetiaTM)和膽固醇合成抑制劑（例如ZocorTM和VytorinTM))聯(lián)用 或并用。能夠治療的個體（對象）包括靈長類動物，人和非人，并包括具有商業(yè)或家庭獸醫(yī) (domestic veterinary)重要性的任何非人哺乳動物或脊椎動物。
[0076] 可通過本領(lǐng)域公知的任何給藥途徑將PCSK9特異性拮抗劑給予個體，所述給藥途 徑包括但不限于口服、注射給藥（【具體實施方式】包括靜脈內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)或肌肉注射）、吸 入給藥、鼻內(nèi)給藥或局部給藥，單獨給藥或與有助于治療個體的其他藥劑聯(lián)合給藥。應根據(jù) 本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的多種考慮來確定給藥途徑，所述考慮包括但不限于治療所需的生理 化學特征?？梢悦咳?、每周、每兩周或每月為基礎(chǔ)，或以能夠在規(guī)定的時間向個體遞送合適 量的PCSK9特異性拮抗劑從而實現(xiàn)并維持所需治療的任何其他方案來提供治療。可單劑量 給予制劑或者分次（atseparatetimes)給予多劑。
[0077]
【具體實施方式】中，治療的病癥選自：高膽固醇血癥、冠心病、代謝綜合征、急性冠狀 動脈綜合征和相關(guān)病癥。PCSK9特異性拮抗劑在制備藥物中的用途形成本發(fā)明的重要實施 方式，所述藥物用于治療PSCK9相關(guān)病癥或者能夠受益于PCSK9拮抗劑的病癥，包括上述那 些病癥。
[0078] 實施例1
[0079]構(gòu)建pcsk9的Fab
[0080] 表達和純化來自于獨特的PCSK9ELISA-陽性克隆的FAB
[0081] 來自ELISA陽性克隆的Fab(F16-15)以及EsB(陰性對照）Fab通過IPTG誘導在 大腸桿菌TGlF-細胞中表達。裂解培養(yǎng)物，通過固定化金屬離子親和層析（IMAC)純化組氨 酸標記的Fab，通過離心滲濾將蛋白交換到25mMHEPESpH7. 3/150mMNaCl中。在Caliper Lab-Chip90和常規(guī)的SDS-PAGE上電泳分析蛋白，用Bradford蛋白測定法定量。系列稀釋 的純化的Fab蛋白用ELISA再測定，以證實純化的Fab的活性。如上所述進行陽性和陰性 對照。用如下所述的外極（EX0P0LAR)(膽固醇攝取）試驗分析純化的Fab制劑。
[0082] 實施例2
[0083] 外極試驗：外源PCSK9對細胞LDL攝取的影響
[0084] 第1天，將30, 000細胞/孔接種在polyD-賴氨酸涂覆的96孔板中。第2天，將 培養(yǎng)基更換為不含血清的DMEM培養(yǎng)基。第3天，除去培養(yǎng)基，用OptiMEM洗滌細胞。將純 化的PCSK9加入到含有LPDS和dl-LDL的100 DMEM培養(yǎng)基中。37°C孵育板6. 5小時。 在含有2mg/mlBSA的TBS中迅速洗滌細胞；然后在TBS-BSA中洗滌2分鐘；然后用TBS(但 快速）洗滌兩次。在1〇〇^11?1?4緩沖液中裂解細胞。然后用￡#20411158〇11111檢測板中的 突光。用BCA蛋白測定法檢測各孔中的總細胞蛋白，并將突光單位（fluorescenceunits)
[0085] 歸一化至總蛋白。
[0086] 外極試驗有效鑒定對LDL攝取的各種效果；參見圖2,圖2說明了在外極試驗中 PCSK9突變體的效力如何與血漿LDL-膽固醇相關(guān)。數(shù)據(jù)如下表所示：
[0087]表1
[0088]
[0089] 結(jié)果：抗體分子F16-15劑量依賴性抑制PCSK9對LDL攝取的影響；可再現(xiàn)性地觀 察到這種效果。加入細胞中的PCSK9的量是約320nM?？贵w分子包含：F16-15對LDL攝取 的PSCK9依賴性影響的劑量依賴性抑制。圖3有兩個對照：⑴僅有細胞的對照，顯示細胞 LDL攝取的基線水平，和（ii)細胞+PCSK9(25/ml)對照，顯示LDL攝取的PCSK9依賴性損失 水平。在圖表中所示PCSK9固定濃度（25/ml)和Fab遞增濃度下進行包括Fab和PCSK9的 滴定試驗。圖3顯示IC-50的計算。1CX1G08顯示對細胞LDL攝取的PCSK9依賴性抑制具 有53%的抑制，而30乂4808顯示61%的抑制。
[0090] 圖4說明了 3BX5C01和3CX2A06對LDL攝取的PSCK9依賴性影響的劑量依賴性抑 制。
[0091] 圖4有兩個對照：（i)僅有細胞的對照，顯示細胞LDL攝取的基線水平，和（ii)細 胞+PCSK9 (25/ml)對照，顯示LDL攝取的PCSK9依賴性損失水平。在圖表中所示PCSK9固 定濃度（25/ml)和Fab遞增濃度下進行包括Fab和PCSK9的滴定試驗。圖4顯示IC-50的 計算。3BX5C01顯示對細胞LDL攝取的PCSK9依賴性抑制具有25%的抑制，而3CX2A06顯 示23%的抑制。圖5A-5B說明了 3CX3D02對LDL攝取的PSCK9依賴性影響的劑量依賴性 抑制。圖5B有兩個對照：（i)僅有細胞的對照，顯示細胞LDL攝取的基線水平，（ii)細胞 +PCSK9 (25/ml)對照，顯示LDL攝取的PCSK9依賴性損失水平。在圖表中所示PCSK9固定濃 度（25/ml)和F16-15遞增濃度下進行包括Fab和PCSK9的滴定試驗。圖5A顯示IC-50的 計算。3CX3D02顯示對細胞LDL攝取的PCSK9依賴性抑制具有23%的抑制。
[0092] 實施例3
[0093] 用表面等離子共振（"SPR"）評估抗體與hPCSK9相互作用的動力學
[0094]用BiacoreTM(PharmaciaBiosensorAB，Uppsala，瑞典）3〇00 系統(tǒng)進打SPR檢測。 傳感器芯片CM5和用于固定的胺偶聯(lián)試劑盒購自BiacoreTM。
[0095] 用Biacore3000控制軟件Wizard中的氨基偶聯(lián)方法將抗體F16-15偶聯(lián)到CM5芯 片的FC2通道上。HBS-EP作為工作緩沖液，3. 3mg/mL的抗體F16-15用pH4. 26,IOmMNaAC 稀釋至終濃度為11Ug/mL。芯片表面用0. 2MEDC和50mMNHSl: 1混合以10iiL/min的流 速進樣7分鐘，然后注射抗體溶液，以pH8. 5,IMethanolamine進樣7分鐘，封閉活化的芯 片表面?？贵wF16-15的最終偶聯(lián)量為8916. 1RU。
[0096]hPCSK9抗原用HBS-EP緩沖液按一定比例進行稀釋為0、1. 18、1. 68、2. 4、3. 4、4. 9、 7. 0和IOnM;抗體與抗原的相互作用分別用Biacore3000控制軟件中的結(jié)合分析Wizard進 行動力學實驗。所有抗原進樣時，流速為20iiL/min，進樣2min，等待2. 5min，解離3min，然 后用HBS-EP緩沖液以30iiL/min的流速進行再生。得到的數(shù)據(jù)根據(jù)Biac〇re3000分析軟 件中的I:ILangmuir結(jié)合模型進行擬合，得到確切的動力學常數(shù)。
[0097] 表3說明了檢測到的本文公開的抗PCSK9抗體F16-15的動力學參數(shù)：
[0098] 表 3
[0099]
[0100] PCSK9特異性抗體作為活體內(nèi)PCSK9拮抗劑的效果
[0101] PCSK9拮抗劑抗體降低小鼠血清膽固醇
[0102] 要決定PCSK9拮抗劑單克隆抗體是否能藉由抑制細胞外PCSK9的功能而影響活體 內(nèi)膽固醇水平,測試F16-15于活體外針對小鼠PCSK9及當被注射至小鼠時對血清膽固醇的 作用。7周齡C57bl/6公鼠被飼養(yǎng)于12小時光/暗循環(huán)下，第-7天采血以收集約70ill的 血清。拮抗劑PCSK9抗體F16-15及對照同種型吻合單克隆抗體于第0、1、2及3天經(jīng)腹腔內(nèi) 注射至7周齡C57bl/6公鼠。小鼠于第4天不禁食犧牲，收集血清樣本。所有冷凍血清樣 本測量總膽固醇、三酸甘油脂、高密度脂蛋白（HDL)膽固醇及LDL膽固醇。圖6顯示F16-15 降低48%的血清膽固醇，然而對照抗體不具任何顯著效果。如預期的，F(xiàn)16-15治療動物的 肝臟LDLR量相較于對照抗體治療者降低（圖6)。
[0103]c.拮抗劑PCSK9單克隆抗體對小鼠血清膽固醇具有延長效果
[0104] 進行時間進程試驗以決定PCSK9拮抗劑抗體于小鼠的膽固醇降低效果的起始時 間及作用期間。單克隆抗體F16-15或鹽水對照各以10mg/kg或3ml/kg經(jīng)靜脈注射至48 只6周齡C57bl/6小鼠。各治療組中8只小鼠于注射后第1、2、4、7、14及21天犧牲。單次 注射F16-15產(chǎn)生快速且延長的血清膽固醇降低效果。注射后24小時可見血清膽固醇降低 25%。見圖7。血清膽固醇最大下降在第7天時間點觀察到。在第21天時，膽固醇下降不 再具有統(tǒng)計顯著性。B部分顯示HDL膽固醇。LDL膽固醇非常低。
[0105] 本發(fā)明的范圍不受所述具體實施方案的限制，所述實施方案只作為闡明本發(fā)明各 個方面的單個例子，本發(fā)明范圍內(nèi)還包括功能等同的方法和組分。實際上，除了本文所述的 內(nèi)容外，本領(lǐng)域技術(shù)人員參照上文的描述和附圖可以容易地掌握對本發(fā)明的多種改進。所 述改進也落入所附權(quán)利要求書的范圍之內(nèi)。上文提及的每篇參考文獻皆全文列入本文作為 參考。
【主權(quán)項】
1. 分離的人PCSK9特異性拮抗劑，其拮抗人PCSK9對細胞LDL攝取的抑制，其中所述人 PCSK9特異性拮抗劑是抗體或其抗原結(jié)合片段，并且其中所述抗體，其中重鏈可變區(qū)CDR1、 CDR2和CDR3序列分別如SEQ ID NO :1、2和3所示；并且輕鏈可變區(qū)CDR1、CDR2和CDR3序 列分別如SEQ ID NO :4、5和6所示。2. 如權(quán)利要求1所述的人PCSK9特異性拮抗劑，其中所述抗體的重鏈可變區(qū)含如SEQ ID NO :7所示和/或所述抗體的輕鏈可變區(qū)含如SEQ ID NO :8所示。3. 如權(quán)利要求1所述的人PCSK9特異性拮抗劑，其中所述抗體的重鏈如SEQ ID NO :9 所示和/或所述抗體的輕鏈如SEQ ID NO : 10所示。4. 組合物，其包含權(quán)利要求1所述的PCSK9特異性拮抗劑和藥學上可接受的載體。5. 權(quán)利要求1所述的PCSK9特異性拮抗劑在制備用于拮抗PCSK9功能的藥物中的用 途。6. 權(quán)利要求1所述的PCSK9特異性拮抗劑在制備藥物中的用途，所述藥物用于改善由 PCSK9功能引起和/或加劇的紊亂、病癥或疾病。7. 編碼權(quán)利要求1所述的PCSK9特異性拮抗劑的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的分離的核 酸。8. 體外或原位的分離的宿主細胞或宿主細胞群體，其包含權(quán)利要求7所述的核酸。9. 體外或原位的分離的宿主細胞或宿主細胞群體，其包含權(quán)利要求1所述的PCSK9特 異性拮抗劑。10. 權(quán)利要求1所述的PCSK9特異性拮抗劑的制備方法，其包括： (a) 在適于產(chǎn)生PCSK9特異性拮抗劑的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求8所述的細胞或細胞群體； 和 (b) 分離所產(chǎn)生的PCSK9特異性拮抗劑。
【專利摘要】本發(fā)明涉及單克隆技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種PCSK9拮抗劑。本發(fā)明進一步提供一種獲得這些抗體的方法以及使用這些抗體以減少低密度脂蛋白(LDL)-膽固醇量及/或供治療及/或預防心血管疾病(其包括治療高膽固醇血癥)的治療方法。
【IPC分類】C12N15/13, A61K39/395, C07K16/40, A61P3/06, C12P21/08, A61P9/00, A61P9/10
【公開號】CN105001336
【申請?zhí)枴緾N201410158415
【發(fā)明人】楊彤, 沈毅珺, 王羅春
【申請人】上海復旦張江生物醫(yī)藥股份有限公司
【公開日】2015年10月28日
【申請日】2014年4月18日