細(xì)胞外酸性環(huán)境在延遲中性粒細(xì)胞凋亡中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明屬于藥物祀點(diǎn)技術(shù)領(lǐng)域，主要設(shè)及調(diào)控人中性粒細(xì)胞生物學(xué)特性的新路徑 和新祀點(diǎn)在臨床上的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 中性粒細(xì)胞來源于骨髓造血干細(xì)胞，是構(gòu)成機(jī)體抵御外源病原體入侵的最前沿， 在機(jī)體天然免疫中扮演著重要的角色。中性粒細(xì)胞是血液循環(huán)中含量最豐富的一類白細(xì) 胞，與淋己細(xì)胞等其它白細(xì)胞不同，中性粒細(xì)胞具有很多獨(dú)特的特性。首先，中性粒細(xì)胞壽 命短。在血液循環(huán)中的中性粒細(xì)胞的半衰期只有8-20小時(shí)，衰老的中性粒細(xì)胞能夠組成型 的自發(fā)調(diào)亡，運(yùn)種調(diào)亡受到細(xì)胞內(nèi)外各種因素的調(diào)控，具有可塑性。其次，中性粒細(xì)胞具有 趨化性，能沿著趨化劑的濃度梯度由低向高遷移。再者，中性粒細(xì)胞具有強(qiáng)大的殺菌功能， 并且，中性粒細(xì)胞輸注在30年前就已存在，并且被證明對(duì)感染的患者有效，但運(yùn)是一把雙 刃劍，即中性粒細(xì)胞在殺菌過程中也會(huì)因旁觀者效應(yīng)導(dǎo)致局部組織損傷和一些炎癥遷延不 愈。因此，基于中性粒細(xì)胞上述特性，尋找和建立一種方法可靠、操作方便的技術(shù)路徑來調(diào) 控中性粒細(xì)胞的一些特性，趨利避害，是當(dāng)前天然免疫學(xué)的一個(gè)重要課題。
[0003] 谷脫甘膚化修飾與憐酸化，甲酯化，泛素化修飾相似，是一種蛋白翻譯后修飾方 式。在肌動(dòng)蛋白中主要發(fā)生在球型肌動(dòng)蛋白374位的半脫氨酸殘基上。肌動(dòng)蛋白的谷脫甘 膚化對(duì)調(diào)節(jié)球型肌動(dòng)蛋白聚合成纖維狀肌動(dòng)蛋白有重要意義。發(fā)生谷脫甘膚化修飾的球型 肌動(dòng)蛋白將不能正常聚合為纖維狀肌動(dòng)蛋白。而肌動(dòng)蛋白的聚合程度又進(jìn)一步影響著細(xì)胞 的功能。因此肌動(dòng)蛋白的谷脫甘膚化對(duì)細(xì)胞的功能的調(diào)節(jié)具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的第一個(gè)目的是在于公開了細(xì)胞外酸性環(huán)境對(duì)中性粒細(xì)胞肌動(dòng)蛋白的谷 脫甘膚化水平的影響。
[0005] 本發(fā)明的另一個(gè)目的在于公開了細(xì)胞外酸性環(huán)境對(duì)中性粒細(xì)胞自發(fā)調(diào)亡及各項(xiàng) 功能的影響，為炎性疾病的治療提供了新的思路和策略。
[0006] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：
[0007] 本發(fā)明提供了細(xì)胞外酸性環(huán)境在降低中性粒細(xì)胞內(nèi)肌動(dòng)蛋白的谷脫甘膚化水平 中的應(yīng)用。
[000引具體地，該應(yīng)用中，細(xì)胞外酸性環(huán)境通過抑制細(xì)胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生，進(jìn)而降低了細(xì) 胞內(nèi)肌動(dòng)蛋白的谷脫甘膚化水平。
[000引優(yōu)選地，所述的細(xì)胞外酸性環(huán)境是指：控制細(xì)胞外環(huán)境的抑值為：6. 0《抑值 <7. 0。更優(yōu)選地，抑值為6. 0-6. 5。
[0010] 具體地，本發(fā)明還提供了一種降低中性粒細(xì)胞肌動(dòng)蛋白的谷脫甘膚化水平的方 法，該方法包括如下步驟：
[0011] 選用RPMI 1640培養(yǎng)基加10% (體積）胎牛血清，調(diào)節(jié)抑值為：6.0《抑值 <7. 0 (用鹽酸或碳酸或乳酸進(jìn)行調(diào)節(jié)），0. 22 y m濾器濾菌，用該培養(yǎng)基對(duì)中性粒細(xì)胞進(jìn)行 體外培養(yǎng)4小時(shí)。
[0012] 更優(yōu)選地，所述抑值為6. 0-6. 5。
[0013] 所述的中性粒細(xì)胞指的是：人外周血來源的中性粒細(xì)胞或小鼠骨髓來源的中性粒 細(xì)胞。
[0014] 本發(fā)明還提供了細(xì)胞外酸性環(huán)境在延遲中性粒細(xì)胞調(diào)亡中的應(yīng)用。
[0015] 具體地，該應(yīng)用中，細(xì)胞外酸性環(huán)境通過抑制細(xì)胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生，降低了細(xì)胞內(nèi) 球狀肌動(dòng)蛋白的谷脫甘膚化水平和促進(jìn)纖維狀肌動(dòng)蛋白的形成，進(jìn)而激活A(yù)kt信號(hào)通路， 引起細(xì)胞調(diào)亡的延遲。
[0016] 優(yōu)選地，所述的細(xì)胞外酸性環(huán)境是指：控制細(xì)胞外環(huán)境的抑值為：6. 0《抑值 <7. 0。更優(yōu)選地，抑值為6. 0-6. 5。
[0017] 具體地，本發(fā)明還提供了一種中性粒細(xì)胞體外保存方法，該方法包括如下步驟：選 用RPMI 1640培養(yǎng)基加10% (體積）胎牛血清，調(diào)節(jié)抑值為：6. 0《抑值<7. 0 (鹽酸或碳 酸或乳酸進(jìn)行調(diào)節(jié)），0. 22 y m濾器濾菌，用該培養(yǎng)基對(duì)中性粒細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)。
[0018] 更優(yōu)選地，所述抑值為6. 0-6. 5。
[0019] 所述的中性粒細(xì)胞指的是：人外周血來源的中性粒細(xì)胞或小鼠骨髓來源的中性粒 細(xì)胞。
[0020] 本發(fā)明所具有的有益效果：
[0021] 本發(fā)明系統(tǒng)檢測(cè)了細(xì)胞外酸性環(huán)境對(duì)中性粒細(xì)胞自發(fā)調(diào)亡及各項(xiàng)功能的影響，探 究了酸性環(huán)境影響中性粒細(xì)胞調(diào)亡和功能的分子機(jī)制，初步闡明了細(xì)胞外酸性環(huán)境通過抑 制細(xì)胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生，降低了細(xì)胞內(nèi)肌動(dòng)蛋白的谷脫甘膚化水平，進(jìn)而激活A(yù)kt信號(hào)通 路，引起細(xì)胞調(diào)亡的延遲和功能的改變。本發(fā)明掲示了微環(huán)境酸堿度在免疫調(diào)節(jié)中的重要 地位，所掲示的調(diào)控人中性粒細(xì)胞生物學(xué)特性的新路徑和新祀點(diǎn)將為今后臨床上設(shè)計(jì)新的 輸血醫(yī)學(xué)儲(chǔ)存和中性粒細(xì)胞的輸注方案、炎性相關(guān)疾病和腫瘤的治療方案提供新的思路和 策略。
【附圖說明】
[0022] 圖 1 中
[0023] a圖為細(xì)胞外酸性環(huán)境對(duì)人外周血中性粒細(xì)胞調(diào)亡情況的測(cè)定結(jié)果圖；
[0024] b圖為細(xì)胞外酸性環(huán)境對(duì)小鼠骨髓中性粒細(xì)胞調(diào)亡情況的測(cè)定結(jié)果圖。
[00巧]圖2中：
[0026] a圖為巧光探針法檢測(cè)不同培養(yǎng)條件下中性粒細(xì)胞活性氧的產(chǎn)生情況；
[0027] b圖為不同培養(yǎng)條件下（P冊(cè).0或抑7. 4,添加激動(dòng)劑或不添加）中性粒細(xì)胞活性 氧的產(chǎn)生情況。
[0028]圖 3 中：
[002引 a圖：不同濃度fMLP刺激下中性粒細(xì)胞的形態(tài)變化。
[0030] b圖：中性粒細(xì)胞對(duì)fMLP刺激的敏感性。
[0031] 圖4中性粒細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖。
[0032] 圖5不同培養(yǎng)條件下中性粒細(xì)胞多偽足出現(xiàn)情況。
[0033] 圖6為驗(yàn)證中性粒細(xì)胞的吞隧作用時(shí)上清液涂板結(jié)果。
[0034] 圖7不同培養(yǎng)條件下細(xì)胞內(nèi)纖維狀肌動(dòng)蛋白巧光強(qiáng)度。
[0035] 圖8.不同培養(yǎng)條件下中性粒細(xì)胞谷脫甘膚化修飾情況。
[0036]圖9中：
[0037] a圖：中性粒細(xì)胞自發(fā)調(diào)亡過程中Akt憐酸化水平的變化趨勢(shì)。
[0038] b圖：不同抑細(xì)胞外培養(yǎng)基對(duì)中性粒細(xì)胞Akt憐酸化水平的影響。
[003引圖10.拉庫(kù)春林對(duì)中性粒細(xì)胞的影響。
[0040] 圖11為酸性環(huán)境調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞調(diào)亡的信號(hào)通路模型圖。
【具體實(shí)施方式】
[0041] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但不限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0042] 本發(fā)明提供了 一種降低中性粒細(xì)胞肌動(dòng)蛋白的谷脫甘膚化水平的方法，該方法包 括如下步驟：選用RPMI 1640培養(yǎng)基加10% (體積）胎牛血清，再用鹽酸或碳酸或乳酸調(diào) 節(jié)抑值為：6. 0《抑值<7. 0 (如抑6. 0, P冊(cè).5)，0. 22 y m濾器濾菌，用該培養(yǎng)基對(duì)中性粒 細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)4小時(shí)。
[0043] 本發(fā)明還提供了一種中性粒細(xì)胞體外保存方法，該方法包括如下步驟：選用RPMI 1640培養(yǎng)基加10% (體積）胎牛血清，再用鹽酸或碳酸或乳酸調(diào)節(jié)抑值為：6. 0《抑值 <7. 0 (如P冊(cè).0, P冊(cè).5)，0. 22 y m濾器濾菌，用該培養(yǎng)基對(duì)中性粒細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)。
[0044] 為了驗(yàn)證細(xì)胞外酸性環(huán)境在降低中性粒細(xì)胞內(nèi)肌動(dòng)蛋白的谷脫甘膚化水平中的 應(yīng)用及細(xì)胞外酸性環(huán)境在延