檢測(cè)Echovirus30病毒的特異性引物、探針及試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及一種病毒性腦炎相關(guān)病毒Echovirus30的特異性檢測(cè)引物、探針及其熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 人類?？刹《?0型（Echovirus30,ECH030)屬于B型腸道病毒，是引起兒童和成 人無(wú)菌性腦膜炎的主要病原體之一。在兒童病毒性腦炎病例中，由ECH030病毒引起的病例 占80~93%。該病毒是一種無(wú)胞膜病毒，能在惡劣的環(huán)境條件（如高鹽、高pH值和37°C) 下穩(wěn)定存活。人在感染人類腸道病毒后的幾周內(nèi)仍能從呼吸道和腸道中排出病毒，從而引 起病毒傳播、感染甚至暴發(fā)流行。
[0003]近年來(lái)在我國(guó)臺(tái)灣、浙江、福建和河南等地多次報(bào)道由ECH030引起病毒性腦炎的 暴發(fā)或流行。2012年5月初，廣東省羅定市報(bào)告一起以發(fā)熱、頭痛、嘔吐為主要臨床癥狀的 腦炎流行。此次疫情共報(bào)道246例腦炎病例，其中ECH030占所有確診分型病例的60 %。自 此，ECH030 -直是廣東省重點(diǎn)監(jiān)測(cè)傳染病之一，其盡快確診可幫助及早發(fā)現(xiàn)疫情，盡快采取 措施，在最小范圍控制疫情，從而把損失減到最少。
[0004]對(duì)人腸道病毒感染進(jìn)行檢測(cè)與分類的試驗(yàn)方法目前在現(xiàn)階段主要有三大類：一是 傳統(tǒng)的病毒分離與血清中和試驗(yàn)；二是人腸道病毒的血清抗體檢測(cè)；三是分子生物學(xué)分型 方法。
[0005]傳統(tǒng)的病毒分離與血清中和試驗(yàn)定型雖然是人腸道病毒檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)，但由于檢 測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、中和試驗(yàn)繁瑣等局限性，作為早期快速檢測(cè)方法有很大的局限性。用于血清學(xué) 檢測(cè)的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA)相對(duì)而言具有方法簡(jiǎn)便、快速等優(yōu)點(diǎn)，但由于人腸道病 毒型別眾多，ELISA-IgM試劑盒多采用混合抗原，特異性較低，不能準(zhǔn)確檢測(cè)出某一血清型 人腸道病毒感染，所以同樣具有局限性。2006年，Nix等通過(guò)對(duì)人腸道病毒遺傳性分析，提 出根據(jù)VPl區(qū)全長(zhǎng)或部分序列同源性大小進(jìn)行腸道病毒型別判斷的標(biāo)準(zhǔn)。針對(duì)ECH030,其 分子分型可通過(guò)利用腸道病毒的通用引物，采用巢式聚合酶鏈反應(yīng)（PCR)擴(kuò)增出目的片段 后，再經(jīng)過(guò)測(cè)序及序列比對(duì)進(jìn)行判定。但該方法對(duì)腦炎病例中ECH030的檢測(cè)技術(shù)要求較 高，在基層醫(yī)院及市、縣級(jí)疾控中心難于普及。另外，該巢式PCR方法靈敏度較低，檢測(cè)周期 較長(zhǎng)導(dǎo)致首發(fā)病人往往不能及時(shí)確認(rèn)病原，而沒有及時(shí)采取有效措施，從而引起疫情蔓延。 每宗疫情在其發(fā)現(xiàn)時(shí)已陷入被動(dòng)局面，進(jìn)而花費(fèi)巨大的人力物力去控制。
[0006]因此，開發(fā)出靈敏、簡(jiǎn)便、快速、經(jīng)濟(jì)、適宜于基層單位推廣使用的ECH030診斷試 劑成為急需解決的難題。
[0007]Real-TimePCR技術(shù)，又稱實(shí)時(shí)定量熒光PCR，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基 團(tuán)，利用熒光信號(hào)累積實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行總量分 析或通過(guò)Ct值對(duì)模板進(jìn)行相對(duì)定量。與常規(guī)PCR相比，實(shí)時(shí)定量PCR無(wú)需取出PCR產(chǎn)物進(jìn) 行分離，它具有特異性更強(qiáng)、有效解決PCR污染問題、自動(dòng)化程度高等特點(diǎn)。作為一個(gè)極有 效的實(shí)驗(yàn)方法，實(shí)時(shí)定量PCR已被廣泛用于人類傳染病的診斷。
[0008] 由于ECH030病毒于近幾年才在我國(guó)有暴發(fā)流行，目前在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中公開的 在我國(guó)流行的ECH030毒株的序列還較少，因此根據(jù)少數(shù)序列較難設(shè)計(jì)出特異的及靈敏的 ECH030病毒檢測(cè)試劑盒。目前，國(guó)內(nèi)尚無(wú)檢測(cè)ECH030病毒的實(shí)時(shí)定量熒光PCR試劑盒，對(duì) ECH030病毒的檢測(cè)仍然依靠巢式PCR的方法和細(xì)胞培養(yǎng)的方法，具有檢測(cè)技術(shù)要求高，檢 測(cè)周期長(zhǎng)，靈敏度差等缺點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 基于此，為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)Ech〇VirUS30病 毒的特異性引物、探針及熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒，解決了現(xiàn)有技術(shù)的對(duì)檢測(cè)技術(shù)要求高， 檢測(cè)周期長(zhǎng)，靈敏度差的缺點(diǎn)。
[0010] 為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采取了以下技術(shù)方案：
[0011] 一種檢測(cè)Echovirus30病毒的特異性引物，所述特異性引物具有如SEQIDN0:2 和SEQIDNO:3所示的堿基組成。
[0012] 一種檢測(cè)Ech〇Virus30病毒的探針，所述探針具有如SEQIDN0:4所示的堿基組 成。
[0013] 在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述探針的5'端帶熒光基團(tuán)FAM，3'端帶淬滅基團(tuán)TAMRA。
[0014] -種檢測(cè)Echovirus30病毒的試劑盒，包括有：上述的檢測(cè)Echovirus30病毒的特 異性引物、和上述的檢測(cè)Echovirus30病毒的探針。
[0015] 在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述檢測(cè)Ech〇VirUS30病毒的試劑盒還包括反應(yīng)緩沖液和 酶反應(yīng)液，所述反應(yīng)緩沖液包括dNTPs、MgCljP穩(wěn)定劑，所述酶反應(yīng)液包括反轉(zhuǎn)錄酶、熱啟 動(dòng)DNA聚合酶和RNase抑制劑。
[0016] 本發(fā)明通過(guò)對(duì)2012年廣東暴發(fā)流行的Echovirus30以及2008-2012年在廣 州環(huán)境污水中檢測(cè)的Echovirus30，共26個(gè)毒株進(jìn)行測(cè)序，同時(shí)結(jié)合Genbank中所有 Echovirus30基因序列，通過(guò)序列比對(duì)，確定相對(duì)保守的片段作為檢測(cè)祀標(biāo)，設(shè)計(jì)特異的檢 測(cè)引物對(duì)和探針，成功研制了Ech〇Virus30病毒實(shí)時(shí)定量熒光PCR檢測(cè)試劑盒。與現(xiàn)有技 術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：
[0017] 1、本發(fā)明檢測(cè)Ech〇VirUS30病毒采用特異性的引物和探針以及優(yōu)化的檢測(cè)體系， 試劑盒靈敏度與特異性均能達(dá)到100%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于國(guó)內(nèi)目前常規(guī)方法即巢式PCR與測(cè)序相 結(jié)合的方法（其靈敏度只有46. 2% );
[0018] 2、本發(fā)明的檢測(cè)Echovirus30病毒的熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒經(jīng)BioRad數(shù)字PCR 儀絕對(duì)定量，該試劑盒可以檢測(cè)到含量低至27. 7copy八d的樣品；
[0019] 3、本發(fā)明的檢測(cè)Echovirus30病毒的方法無(wú)需對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，大大縮短了 現(xiàn)有方法的檢測(cè)周期；
[0020] 4、本發(fā)明的Ech〇Virus30病毒的實(shí)時(shí)定量熒光PCR檢測(cè)試劑盒通過(guò)檢測(cè)腦脊液、 奠便等標(biāo)本中Echovirus30病毒核酸，可對(duì)感染Echovirus30病毒的病人進(jìn)行早期診斷，填 補(bǔ)了國(guó)內(nèi)針對(duì)Echovirus30病毒的試劑盒的空白。
【附圖說(shuō)明】
[0021] 圖1為本發(fā)明試驗(yàn)例1中陽(yáng)性樣本的檢測(cè)結(jié)果，其中A為26份細(xì)胞分離鑒定為陽(yáng) 性標(biāo)本的巢式PCR第一輪凝膠電泳圖；B為26份細(xì)胞分離鑒定為陽(yáng)性標(biāo)本的巢式PCR第二 輪凝膠電泳圖；C為26份細(xì)胞分離鑒定為陽(yáng)性標(biāo)本的熒光定量PCR擴(kuò)增曲線圖；
[0022] 圖2為本發(fā)明試驗(yàn)例3中數(shù)字PCR儀的絕對(duì)定量結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0023] 下面將結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。但這些實(shí)施例僅限于說(shuō)明本發(fā)明而 不是對(duì)本發(fā)明的保護(hù)范圍的進(jìn)一步限定。
[0024] 以下實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等 人，分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(cè)（NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress, 1989)中所述 的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例中所用到的各種常用化學(xué)試劑，均為市售產(chǎn) 品。
[0025] 實(shí)施例1 一種Echovirus30病毒的實(shí)時(shí)定量熒光PCR檢測(cè)試劑盒
[0026] 本實(shí)施例所述的檢測(cè)試劑盒的制備包括以下步驟：
[0027]1、確宙檢測(cè)的靶標(biāo)及特異引物及探針
[0028] 通過(guò)對(duì)廣東省菌毒種庫(kù)保藏的共26株ECH030病毒進(jìn)行測(cè)序，同時(shí)結(jié)合GenBank 中的共29條ECH030病毒序列，通過(guò)目的基因VPl的序列比對(duì)確定相對(duì)保守的片段SEQID NO: 1作為檢測(cè)的靶序列；
[0029] 應(yīng)用Bioedit以及PrimerPremier5. 0等軟件對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，針對(duì)SEQ IDNO: 1 序列，設(shè)計(jì)qPCR引物對(duì)SEQIDNO: 2 和SEQIDNO: 3 和Taqman探針SEQIDNO: 4。 引物和Taqman探針?biāo)徒簧锕竞铣伞?br>[0030] 具體序列如下：
[0031] 檢測(cè)的靶序列SEQIDN0:1 :KM034804(7-132nt)
[0032] 5'-cctgaaagtgcaatcaacagg