在非離子有機(jī)聚合物和正電性表面存在下的蛋白質(zhì)純化的制作方法
【專利說明】在非離子有機(jī)聚合物和正電性表面存在下的蛋白質(zhì)純化
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)的聲明
[0002] 本申請(qǐng)要求2013年2月26日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/769, 416的優(yōu)先權(quán)，該美 國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)以引用的方式整體并入本文。
【背景技術(shù)】
[0003] 本文公開的這些實(shí)施方案涉及用于純化包括抗體在內(nèi)的蛋白質(zhì)的方法，所述抗 體包括IgG單克隆抗體。使用諸如聚乙二醇（PEG)之類的非離子有機(jī)聚合物使蛋白質(zhì) 沉淀的技術(shù)是已知的。它最常在低鹽濃度下，在不添加鹽的情況下使用，但是例外情況 是已知的（D. Gervais 等人的美國(guó)專利申請(qǐng) 2010/0204455A1 ;K. Ingham, Arch. Biochem. Biophys. 186(1978) 106-113 ;Κ· Yamamoto 等人，Virology, 40(1970)734-744 ;S. Branston 等人，Biotechnol. Progr. 28 (2012) 129-136) 〇
[0004] 空間排阻色譜的技術(shù)是已知的（J. Lee等人，J. Chromatogr. A 1270 (2012) 162-170 ;還參見PCT/SG2012/000199,該文獻(xiàn)以引用的方式并入本文并且作為 附錄A隨附）。它利用非離子親水性表面，通過諸如PEG之類的非離子有機(jī)聚合物引起所 需產(chǎn)物在所述表面上的保留。已經(jīng)報(bào)道NaCl濃度升高會(huì)提高病毒結(jié)合效率（Lee等人（同 上））。已經(jīng)報(bào)道在升高濃度的NaCl存在下在流化顆粒上進(jìn)行所述技術(shù)會(huì)提高IgG制劑的 回收率和純度（P. Gagnon 等人，J. Chromatogr. A, 2014, 1324, 171-180) 〇
[0005] 陰離子交換色譜是已知的，并且廣泛地用于蛋白質(zhì)的純化。它利用帶正電荷的 表面，當(dāng)施用于無鹽或少鹽的水溶液中時(shí)，蛋白質(zhì)自發(fā)地結(jié)合在所述表面上。在PEG存 在下陰離子交換色譜的性能是已知的，其中與在不存在PEG的情況下相比，PEG的存在使 得蛋白質(zhì)在更高的鹽濃度下從填充有多孔顆粒陰離子交換劑的柱中洗脫，并且其中蛋白 質(zhì)越大，則洗脫所述蛋白質(zhì)所需的鹽濃度的增加越大（P. Gagnon等人，J. Chromatogr. A 743(1996)51-55) 〇
[0006] 已經(jīng)描述了用于降低含有單克隆抗體的細(xì)胞培養(yǎng)收獲物中染色質(zhì)的含量的方法 (H. Gan等人，J. Chromatogr. A，1291 (2013) 33-40)。染色質(zhì)已知包括處于被稱為核小體的 穩(wěn)定締合體中的DNA和組蛋白。Gan等人報(bào)道了染色質(zhì)和它的分解代謝物還與抗體形成締 合體，這限制了后續(xù)的分級(jí)分離方法的功效。他們報(bào)道了實(shí)現(xiàn)99 %的染色質(zhì)減少的方法，并 且進(jìn)一步報(bào)道了這種減少提高了通過陽(yáng)離子交換色譜所獲得的純化的質(zhì)量。由Gan等人報(bào) 道的技術(shù)的一種變化方案已經(jīng)由Gagnon等人（2013,同上）報(bào)道以提高通過在流化親水性 顆粒上進(jìn)行空間排阻色譜所分級(jí)分離的IgG的回收率和純度。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明提供了一種從制品中純化所需蛋白質(zhì)的方法，所述方法包括（a)以在原始 產(chǎn)生培養(yǎng)基中存在有少于約5%的染色質(zhì)的形式提供所述制品；(b)使所述制品與非離子 有機(jī)聚合物和鹽接觸，其中非離子有機(jī)聚合物的濃度足以使所述所需蛋白質(zhì)沉淀或使得它 附著在親水性表面上，或?qū)⑺S持在沉淀的狀態(tài)或附著在所述親水性表面上，所述鹽濃度 足以產(chǎn)生大于生理電導(dǎo)率；以及（C)使所述制品與至少一種正電性表面接觸，其中所述所 需的蛋白質(zhì)基本上不吸附到所述至少一種正電性表面上，同時(shí)不阻止酸性污染物吸附到所 述至少一種正電性表面上，所述接觸任選地在足以產(chǎn)生大于生理電導(dǎo)率的鹽濃度存在下進(jìn) 行。
【具體實(shí)施方式】
[0008] 已經(jīng)驚人地發(fā)現(xiàn)在對(duì)已經(jīng)被調(diào)節(jié)以去除至少95%的染色質(zhì)的不純制品進(jìn)行PEG 介導(dǎo)的分級(jí)分離方法時(shí)，所述PEG介導(dǎo)的方法可以實(shí)現(xiàn)比已知的高功能的生物學(xué)親和色譜 方法更高程度的蛋白質(zhì)純化，并且所述PEG介導(dǎo)的方法包括其中沉淀混合物含有升高濃度 的鹽的至少一個(gè)階段，以及其中存在至少一種正電性表面的至少一個(gè)階段，以及其中PEG 和所需蛋白質(zhì)的混合物與至少一種正電性表面在相對(duì)缺乏鹽的情況下發(fā)生接觸的至少一 個(gè)階段。
[0009] 在一些實(shí)施方案中，提供了用于從被調(diào)節(jié)以去除至少95%的染色質(zhì)的不純制品中 純化所需蛋白質(zhì)的多步方法，所述方法包括以下步驟：（i)在同時(shí)存在足以產(chǎn)生大于正常 生理電導(dǎo)率的電導(dǎo)率的濃度的鹽的情況下，使所述不純制品與足以引起所需抗體被沉淀的 量的非離子有機(jī)聚合物接觸；（ii)在至少一種正電性表面存在下從所述混合物中減少或 消除鹽；（iii)使所述非離子有機(jī)聚合物減少到不足以將所需的蛋白質(zhì)維持在沉淀狀態(tài)的 濃度；以及（iv)將所述至少一種正電性表面與所述制品分離，留下被高度純化的所需蛋白 質(zhì)，如果需要的話，可以通過另外的分級(jí)分離方法對(duì)所述所需蛋白質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步純化。在一 個(gè)這樣的實(shí)施方案中，所需蛋白質(zhì)是IgG。
[0010] 在一些實(shí)施方案中，提供了用于從被調(diào)節(jié)以去除至少95%的染色質(zhì)的不純制品 中純化所需蛋白質(zhì)的多步方法，所述方法包括以下步驟：（i)在同時(shí)存在足以產(chǎn)生大于正 常生理電導(dǎo)率的電導(dǎo)率的濃度的鹽的情況下，使所述不純制品與足以引起所需蛋白質(zhì)被沉 淀的量的非離子有機(jī)聚合物接觸；（ii)從所述混合物中減少或消除鹽；（iii)在至少一種 正電性表面存在下，使所述非離子有機(jī)聚合物減少到不足以將所需的蛋白質(zhì)維持在沉淀狀 態(tài)的濃度；以及（iv)將所述至少一種正電性表面與所述制品分離，留下被高度純化的蛋白 質(zhì)，如果需要的話，可以通過另外的分級(jí)分離方法對(duì)所述蛋白質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步純化。在一個(gè)這 樣的實(shí)施方案中，所需蛋白質(zhì)是IgG。
[0011] 在一些實(shí)施方案中，提供了用于從被調(diào)節(jié)以去除至少99%的染色質(zhì)的不純制品中 純化所需蛋白質(zhì)的多步方法，所述方法包括以下步驟：（i)使所述不純制品與足以引起所 需蛋白質(zhì)被沉淀的量的非離子有機(jī)聚合物接觸；（ii)將鹽添加到經(jīng)過調(diào)節(jié)的收獲物和非 離子有機(jī)聚合物的組合中，達(dá)到足以產(chǎn)生大于正常生理電導(dǎo)率的電導(dǎo)率的濃度；（iii)在 至少一種正電性表面存在下從所述混合物中減少或消除鹽；（iv)在至少一種正電性表面 存在下，使所述非離子有機(jī)聚合物減少到不足以將所需蛋白質(zhì)維持在沉淀狀態(tài)的濃度；以 及（V)將所述至少一種正電性表面與所述制品分離，留下被高度純化的蛋白質(zhì)，如果需要 的話，可以通過另外的分級(jí)分離方法對(duì)所述蛋白質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步純化。在一個(gè)這樣的實(shí)施方 案中，所需蛋白質(zhì)是IgG。
[0012] 在一些實(shí)施方案中，提供了用于從被調(diào)節(jié)以去除至少95%的染色質(zhì)的不純制品中 純化所需蛋白質(zhì)的多步方法，所述方法包括以下步驟：（i)使所述不純制品與足以引起所 需蛋白質(zhì)被沉淀的量的非離子有機(jī)聚合物接觸；（ii)將鹽添加到經(jīng)過調(diào)節(jié)的收獲物和非 離子有機(jī)聚合物的組合中，達(dá)到足以產(chǎn)生大于正常生理電導(dǎo)率的電導(dǎo)率的濃度；（iii)從 所述混合物中減少或消除鹽；（iv)在至少一種正電性表面存在下，使所述非離子有機(jī)聚合 物減少到不足以將所需蛋白質(zhì)維持在沉淀狀態(tài)的濃度；以及（V)將所述至少一種正電性表 面與所述制品分離，留下被高度純化的IgG，如果需要的話，可以通過另外的分級(jí)分離方法 對(duì)所述IgG進(jìn)行進(jìn)一步純化。在一個(gè)這樣的實(shí)施方案中，所需蛋白質(zhì)是IgG。
[0013] 在一些實(shí)施方案中，提供了用于從被調(diào)節(jié)以去除至少95%的染色質(zhì)的不純制品中 純化所需蛋白質(zhì)的多步方法，所述方法包括以下步驟：（i)在同時(shí)存在足以產(chǎn)生大于正常 生理電導(dǎo)率的電導(dǎo)率的濃度的鹽的情況下，使所述不純制品與足以引起所需蛋白質(zhì)被沉淀 的量的非離子有機(jī)聚合物接觸；（ii)從所述混合物中減少或消除鹽；（iii)使所述非離子 有機(jī)聚合物減少到不足以將所需蛋白質(zhì)維持在沉淀狀態(tài)的濃度，然后使所述混合物與至少 一種正電性表面接觸；以及（iv)將所述至少一種正電性表面與所述制品分離，留下被高度 純化的蛋白質(zhì)，如果需要的話，可以通過另外的分級(jí)分離方法對(duì)所述蛋白質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步純 化。在一個(gè)這樣的實(shí)施方案中，所述蛋白質(zhì)是IgG。
[0014] 在一些實(shí)施方案中，所述方法的至少一個(gè)階段涉及所需蛋白質(zhì)與至少一種正電性 表面在基本上阻止所述所需蛋白質(zhì)吸附到該表面的條件下發(fā)生接觸。在一些這樣的實(shí)施方 案中，所述所需蛋白質(zhì)是IgG抗體。在一些這樣的實(shí)施方案中，所述所需蛋白質(zhì)是單克隆 IgG抗體。
[0015] 在一些實(shí)施方案中，所述方法的至少一個(gè)階段涉及所需蛋白質(zhì)與至少一種正電性 表面在使得基本上全部的所需蛋白質(zhì)吸附到該至少一種正電性表面上的條件下發(fā)生接觸。 在一些這樣的實(shí)施方案中，所述所需蛋白質(zhì)是IgM抗體。在一些這樣的實(shí)施方案中，所述所 需蛋白質(zhì)是單克隆IgM抗體。在一些實(shí)施方案中，所述所需蛋白質(zhì)是非抗體蛋白質(zhì)。在一 些這樣的實(shí)施方案中，所述所需蛋白質(zhì)是凝血因子。在一些這樣的實(shí)施方案中，所述所需的 蛋白質(zhì)是纖維蛋白原。在一些實(shí)施方案中，所述所需蛋白質(zhì)是因子VIII。在一些這樣的實(shí) 施方案中，所述所需蛋白質(zhì)是因子VIII和血管性血友病因子（von Willebrand factor)的 復(fù)合體，所述復(fù)合體也被稱為抗血友病因子。
[0016] 在先前實(shí)施方案中的任一個(gè)中，所述至少非離子親水性表面可以任選地存在于所 述方法的任何階段直到將所述至少一種正電性表面與被純化的蛋白質(zhì)分離。在一些這樣的 實(shí)施方案中，所述至少一種非離子親水性表面是整體柱（monolith)。在一些這樣的實(shí)施方 案中，所述至少一種非離子親水性表面呈膜的形式。在一些這樣的實(shí)施方案中，所述至少一 種非離子親水性表面由多個(gè)顆粒組成。在一些這樣的實(shí)施方案中，非離子親水性顆?？梢?具有10納米、或100納米、或1微米、或10微米、或100微米、或者中間尺寸或更大尺寸的 平均尺寸。在一些這樣的實(shí)施方案中，所述顆?？梢允谴判缘幕蝽槾判缘?，從而使得能夠在 磁場(chǎng)中或在磁性表面上對(duì)它們進(jìn)行收集。
[0017] 在先前實(shí)施方案中的任一個(gè)中，至少一種正電性表面可以呈多個(gè)流化正電性顆粒 的形式。在一些這樣的實(shí)施方案中，所述顆?？梢允潜恢圃煊糜谠谥羞M(jìn)行色譜的顆粒。 在一些這樣的實(shí)施方案中，所述顆?？梢员环Q為陰離子交換色譜顆粒。在一些實(shí)施方案中， 所述顆?？梢员环Q為混合模式的色譜顆粒，指的是如下的情形，其中除了具有正電性之外， 所述顆粒還體現(xiàn)出參與和抗體制品的組分發(fā)生的其它類型的化學(xué)相互作用的能力，所述化 學(xué)相互作用如疏水性相互作用、氫鍵合、以及配位鍵合或金屬親和相互作用。在一些實(shí)施方 案中，所述顆粒還可以包括負(fù)電荷，只要所述顆粒上的凈電荷是正的即可。在一些實(shí)施方案 中，正電性顆?？梢跃哂?0納米、或100納米、或1微米、或10微米、或100微米、或者中間 尺寸或更大尺寸的平均尺寸。在一些實(shí)施方案中，所述顆?？梢允谴判缘幕蝽槾判缘模瑥亩?使得能夠在磁場(chǎng)中或在磁性表面上對(duì)它們進(jìn)行收集。
[0018] 在其中所述至少一種正電性表面包含多個(gè)顆粒的一些實(shí)施方案中，顆粒的比例可 以占在添加顆粒時(shí)制品體積的1%、或2%、或3%、或4%、或5%、或10%、或更少的比例、 或更多的比例、或中間的比例。將認(rèn)識(shí)到的是，顆粒的實(shí)際比例將隨顆粒的尺寸、它們的表 面特征、IgG的特征、以及仍存在于制品中的污染物的量和特征而變。為了實(shí)現(xiàn)初始的實(shí)驗(yàn) 目的，以IgG制品的體積/體積比例計(jì)，以2%至5%的顆粒開始將是適宜的。
[0019] 在先前實(shí)施方案中的任一個(gè)中，至少一種正電性表面可以呈多孔膜的形式。在一 些這樣的實(shí)施方案中，膜的平均孔徑可以是lOOnm、或220nm、或450nm、或1微米、或2微米、 或更小的尺寸、中間的尺寸、或更大的尺寸。在一些這樣的實(shí)施方案中，膜的平均孔徑可以 是220nm。在一些這樣的實(shí)施方案中，膜的平均孔徑可以是450nm。鑒于膜的功能將在于保 留PEG誘導(dǎo)的沉淀物和/或親水性顆粒，具有保留那些物質(zhì)的最大孔徑分布的膜將是優(yōu)選 的，這是因?yàn)樗€將支持最高的跨膜流體傳輸速率，這進(jìn)而將支持最短的處理時(shí)間。在一些 這樣的實(shí)施方案中，所述膜可以被稱為陰離子交換色譜膜或陰離子交換膜吸附器。在一些 實(shí)施方案中，所述膜可以被稱為混合模式的色譜膜，指的是如下的情形，其中除了具有正電 性之外，所述膜還體現(xiàn)出參與和不純制品的組分發(fā)生的其它類型的化學(xué)相互作用的能力， 所述化學(xué)相互作用如疏水性相互作用、氫鍵合、以及配位鍵合或金屬親和相互作用。在一些 實(shí)施方案中，所述膜還可以包括負(fù)電荷，只要在正常操作條件下所述膜上的凈電荷是正的 即可。
[0020] 在一些實(shí)施方案中，至少一種正電性表面的正電性可以是由含氮化合物賦予的。 在一些這樣的實(shí)施方案中，所述含氮化合物可以是伯氨基、或仲氨基、或叔氨基、或季氨基、 或這些基團(tuán)的組合或聚合物。在一些這樣的實(shí)施方案中，所述含氮化合物可以是三（2-氨 乙基）胺（TREN)。在一些實(shí)施方案中，帶正電荷的含氮基團(tuán)可以是亞胺、或吡啶、或其它正 電性基團(tuán)。在一些實(shí)施方案中，含氮化合物的正電荷可以存在于除氮原子以外的殘基（如 硫原子）上。
[0021] 在一些實(shí)施方案中，可以使用切向流過濾設(shè)備中所容納的正電性膜來實(shí)施所公開 的方法，所述設(shè)備可以根據(jù)需要在不同的程度上被自動(dòng)化。在一些這樣的實(shí)施方案中，正電 性膜還可以發(fā)揮保留被沉淀的IgG的功能，包括在IgG制品含有部分阻止或高度阻止或完 全阻止膜上的正電荷與不純制劑的組分上的負(fù)電荷之間的靜電相互作用的濃度的鹽時(shí)。
[0022] 在一些實(shí)施方案中，在至少一種正電性表面不發(fā)揮保留被沉淀的IgG的功能的情 況下，它可以由膜裝置或整體柱、或填充顆粒的柱組成。
[0023] 在一些實(shí)施方案中，可以使用切向流過濾設(shè)備中標(biāo)稱不帶電荷的膜實(shí)施所述方 法，其中所述不帶電荷的膜發(fā)揮保留被沉淀的IgG的功能。在一個(gè)這樣的實(shí)施方案中，所述 不帶電荷的膜還可以發(fā)揮保留正電性顆粒的功能。在一個(gè)相關(guān)實(shí)施方案中，所述不帶電荷 的膜可二者擇其一地發(fā)揮保留正電性顆粒的功能。
[0024] 在一些實(shí)施方案中，可以使用死端過濾介質(zhì)來實(shí)施所述方法，其中沉淀物被保留， 而未沉淀的污染物通過并且因此被消除。
[0025] 在一些實(shí)施方案中，可以使用離心來實(shí)施所述方法，其中使沉淀物沉降，從而使得 能夠處置含有污染物的上清液。
[0026] 在一些實(shí)施方案中，在其中酸性污染物被認(rèn)為與至少一種正電性表面結(jié)合的低鹽 階段或無鹽階段，IgG制品中PEG的濃度可以是容許IgG變得可溶的PEG的最高濃度，意圖 是PEG促進(jìn)污染物與膜的結(jié)合。在其它實(shí)施方案中，在重新溶解的IgG中PEG的濃度可以 是最低的可能的濃度以最小化樣品的粘度和/或有助于其隨后的去除。已知在溶解的IgG 中PEG的濃度可以具有一定的實(shí)際價(jià)值，進(jìn)行簡(jiǎn)單的實(shí)驗(yàn)來鑒定在具體的情形下最佳服務(wù) 于實(shí)驗(yàn)利益的濃度在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。
[0027] 在一些實(shí)施方案中，足以產(chǎn)生大于正常生理電導(dǎo)率的電導(dǎo)率的鹽的濃度可以顯著 大于正常的生理電導(dǎo)率。在正常的電導(dǎo)率可以在12mS/cm至16mS/cm的范圍的情況下，被 認(rèn)為是顯著更大的值可以包括20mS/cm、或30mS/cm、或40mS/cm、或50mS/cm、或60mS/cm、或 70mS/cm、或 80mS/cm、或 90mS/cm、或 100mS/cm、或 150mS/cm、或 200mS/cm、或者中間的值或 更高的值，例如高達(dá)飽和NaCl溶液的電導(dǎo)率。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明可以在約50mS/cm至150mS/cm 的范圍或?qū)?yīng)于約0. 5M至I. 5M的范圍的NaCl濃度的范