通過芳香族化合物生產(chǎn)7-碳化學物的方法
【技術領域】
[0001] 本申請涉及使用一種或多種分離的酶例如脫氫酶、還原酶、水解酶、水合酶、 硫酯酶、可逆CoA-連接酶、CoA-轉(zhuǎn)移酶、裂合酶、合酶、脫乙酰基酶、或轉(zhuǎn)氨酶，或使用 表達一種或多種這類酶的重組宿主細胞，從分支酸（chorismate)、苯甲酰-CoA或苯 甲酸生物合成以下一種或多種物質(zhì)的方法：庚二酸、7-氨基庚酸、7-羥基庚酸、庚二胺 (heptamethylenediamine)和 1，7_ 庚二醇（下文稱為 "C7 結構單元"）。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 尼龍是聚酰胺，其有時通過二胺與二羧酸的縮聚合成。類似地，尼龍可通過 內(nèi)酰胺的縮聚生成。一種無處不在的尼龍是尼龍6,6,其通過六亞甲基二胺（HMD)和 己二酸的反應生成。尼龍6通過己內(nèi)酰胺的開環(huán)聚合生成（Anton&Baird,Polyamides Fibers,EncyclopediaofPolymerScienceandTechnology, 2001)〇
[0004] 尼龍7和尼龍7, 7代表與尼龍6和尼龍6, 6相比具有增值特征的新型聚 酰胺。尼龍7是通過7-氨基庚酸聚合生成的，而尼龍7, 7是通過庚二酸和庚二胺 (heptamethylenediamine)的縮聚生成的。不存在生成用于尼龍7和尼龍7, 7的單體的經(jīng) 濟上可行的石油化學路徑。
[0005] 鑒于沒有經(jīng)濟上可行的石油化學單體給料；生物技術提供了一種經(jīng)由生物催化的 備選方法。生物催化是使用生物催化劑（諸如酶）來實施有機化合物的生物化學轉(zhuǎn)化。
[0006] 生物衍生給料和石油化學給料兩者是用于生物催化過程的可行起始材料。
[0007] 因而，針對此背景，清楚的是需要用于生成庚二酸、7-氨基庚酸、7-羥基庚酸、庚 二胺和1，7-庚二醇（heptanediol)(下文為"C7結構單元"）的方法，其中所述方法是基于 生物催化劑的。
[0008] 然而，無野生型原核生物或真核生物天然過度生成C7結構單元或?qū)⑵渑懦鲋涟?外環(huán)境。不過，已經(jīng)報告了庚二酸的代謝。
[0009] 二羧酸庚二酸作為碳源經(jīng)由氧化被眾多細菌和真菌有效轉(zhuǎn)化成中心代謝 物。輔酶A(CoA)活化的庚二酸到CoA活化的3-氧代庚二酸的0 -氧化經(jīng)由例如與芳香 族底物降解有關的途徑促進進一步代謝。已經(jīng)廣泛表征了 3-氧代庚二?；?CoA被幾種 細菌分解代謝成乙酰基-CoA和戊二酰基-CoA(HarwoodandParales,AnnualReviewof Microbiology, 1996, 50:553 - 590)。
[0010] 最優(yōu)性原理陳述微生物調(diào)節(jié)其生物化學網(wǎng)絡以支持最大生物量生長。超出宿主 生物體中表達異源路徑的需要，將碳流量引向充當碳源而非充當生物量生長成分的C7結 構單元與最優(yōu)性原理矛盾。例如，與天然生產(chǎn)者的產(chǎn)量性能相比，將1-丁醇途徑從梭菌 (Clostridium)物種轉(zhuǎn)移入其它生產(chǎn)菌株中經(jīng)常下降一個數(shù)量級（Shen等，Appl.Environ. Microbiol. , 2011, 77(9) :2905 - 2915) 〇
[0011] 在C7脂肪族主鏈上形成末端官能團（諸如羧基、胺或羥基基團）前，7碳脂肪族主 鏈前體的有效合成是合成C7結構單元中的重要考慮因素。
[0012] 發(fā)明概述
[0013] 本申請至少部分地基于以下發(fā)現(xiàn)：可構建用于生產(chǎn)七碳鏈式脂族主鏈前體的生物 化學途徑，其中可形成一個或兩個官能團，即羧基、胺或者羥基，導致以下一種或者多種物 質(zhì)的合成：庚二酸、7-氨基庚酸、7-羥基庚酸、庚二胺和1，7-庚二醇（下文稱為"C7結構單 元")。庚二酸和庚二酸鹽（酯），7-羥基庚酸和7-羥基庚酸鹽（酯），7-氨基庚酸和7-氨 基庚酸鹽（酯）本文中可替換使用，指代以其任意中性或離子化形式的化合物，包括其任意 的鹽形式。本領域的技術人員應當理解具體的形式將依賴于pH。本文描述的這些途徑、代 謝工程和培養(yǎng)策略依賴于與厭氧芳香族底物降解途徑相關的酶或類似物酶。
[0014] 面對最優(yōu)性原理，令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，可將適當?shù)姆翘烊煌緩?、給料、宿主微生物、對 宿主的生物化學網(wǎng)絡的弱化策略和培養(yǎng)策略組合起來，從而高效地生產(chǎn)一種或多種C7結 構單元。
[0015] 在一些實施方案中，用于轉(zhuǎn)化為一種或多種C7結構單元的C7脂族主鏈是庚二 酰-CoA(也稱為6-羧基己酰-CoA)，其可以通過厭氧苯甲酰-CoA降解途徑從分支酸或苯甲 酸形成。見圖1。
[0016] 在一些實施方案中，末端羧基基團可使用硫酯酶、醛脫氫酶、6-氧代己酸脫氫酶、 7_氧代庚酸脫氫酶、可逆CoA-連接酶、或CoA-轉(zhuǎn)移酶酶促形成。見圖2。
[0017] 在一些實施方案中，末端胺基團可以使用轉(zhuǎn)氨酶或者脫乙?；该复傩纬?。 見圖3和圖4。
[0018] 在一些實施方案中，末端羥基基團可以使用4-羥基丁酸脫氫酶、5-羥基戊酸脫氫 酶、6-羥基己酸脫氫酶或醇脫氫酶形成。見圖5和圖6。
[0019] 在一個方面，本申請的特征在于一種用于生物合成選自下組的產(chǎn)物的方法：庚二 酸、7-氨基庚酸、7-羥基庚酸、庚二胺和1，7-庚二醇。所述方法包括從苯甲酰-CoA酶促 合成七碳鏈式脂族主鏈（例如庚二酰-CoA或苯甲酸），以及在所述主鏈中酶促形成一個或 兩個選自羧基、胺和羥基基團的末端官能團，從而形成所述產(chǎn)物?？梢詮姆种嵬ㄟ^苯甲 酰-CoA降解來酶促合成庚二酰-CoA。苯甲酰-CoA還原酶能夠?qū)⒈郊柞?CoA轉(zhuǎn)化為環(huán) 己-1，5-二烯-1-羰基-CoA。分支酸裂合酶能夠?qū)⒎种徂D(zhuǎn)化為4-羥基苯甲酸，或者鄰氨 基苯甲酸合酶能夠?qū)⒎种徂D(zhuǎn)化為鄰氨基苯甲酸?？梢杂?-酮環(huán)己烷-1-羧基-CoA水解 酶從2-酮環(huán)己烷-1-羧基-CoA酶促合成庚二酰-CoA。
[0020] 所述兩個末端官能團可以是相同的（例如胺或羥基），或者可以是不同的（例如末 端胺和末端羧基基團；或末端羥基基團和末端羧基基團）。
[0021] co-轉(zhuǎn)氨酶或者脫乙?；缚梢悦复傩纬砂坊鶊F。所述轉(zhuǎn)氨酶可以與列于SEQ IDN0. 8-13中的任一氨基酸序列具有至少70%的序列同一性。
[0022] 6-羥基己酸脫氫酶、5-羥基戊酸脫氫酶、4-羥基丁酸脫氫酶、或醇脫氫酶可以酶 促形成羥基基團。
[0023] 硫酯酶、醛脫氫酶、7-氧代庚酸脫氫酶、6-氧代己酸脫氫酶、CoA-轉(zhuǎn)移酶（例如戊 烯二酸CoA轉(zhuǎn)移酶）、或可逆CoA-連接酶（例如可逆琥珀酸-CoA連接酶）可以酶促形成末 端羧基基團。所述硫酯酶可以與列于SEQIDN0:1中的氨基酸序列具有至少70%的序列同 一性。
[0024] 羧酸還原酶和磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶能夠形成末端醛基，作為形成所述產(chǎn)物 的中間物。所述羧酸還原酶可以與列于SEQIDN0. 2-7中的任一氨基酸序列具有至少70% 的序列同一,性。
[0025] 任意所述方法可以通過發(fā)酵在重組宿主中進行。所述宿主可以經(jīng)受厭氧、微氧或 混合的氧/反硝化培養(yǎng)條件下的培養(yǎng)策略。所述宿主可以在營養(yǎng)物限制的條件下培養(yǎng)。所 述宿主可以使用陶瓷中空纖維膜保留以維持發(fā)酵期間的高細胞密度。最終電子受體可以是 氧的替代物，例如硝酸鹽。
[0026] 在任意所述方法中，所述宿主對高濃度C7結構單元的耐受可以通過在選擇環(huán)境 中連續(xù)培養(yǎng)來改善。
[0027] 進料至發(fā)酵的主要碳源可以衍生自生物或非生物給料。在一些實施方案中，所述 生物給料是以下物質(zhì)，包括以下物質(zhì)，或衍生自以下物質(zhì)：單糖、二糖、木質(zhì)纖維素、半纖維 素、纖維素、木質(zhì)素、乙酰丙酸和甲酸、甘油三酯、甘油、脂肪酸、農(nóng)業(yè)廢物、濃縮的酒糟可溶 物或城市廢物。
[0028] 在一些實施方案中，所述非生物給料是以下物質(zhì)，或衍生自以下物質(zhì)：天然氣、合 成氣、C02/H2、甲醇、乙醇、苯甲酸、來自環(huán)己烷氧化過程的非揮發(fā)性殘留物（NVR)或者堿洗 廢物流，或?qū)Ρ蕉姿?異酞酸混合物廢物流。
[0029] 本申請的特征還在于重組宿主，其包括至少一種外源性核酸，所述外源性核酸編 碼（i)分支酸裂合酶或鄰氨基苯甲酸合酶；（ii)苯甲酰-CoA還原酶和（iii) 2-酮環(huán)己 烷-1-羧基-CoA水解酶，所述宿主生產(chǎn)庚二酰-CoA。所述宿主進一步可以包含（i) 一種或 多種以下物質(zhì)：4_羥基苯甲酸-CoA連接酶、CoA-轉(zhuǎn)移酶（例如琥J白酰-CoA:苯甲酸CoA-轉(zhuǎn) 移酶）、4-羥基苯甲酰-CoA還原酶、環(huán)己-1-烯-1-羧基-CoA脫氫酶、環(huán)己-1-烯-1-羧 基-CoA水合酶、或2-羥基環(huán)己烷羧基-CoA脫氫酶；或（ii) 一種或多種以下物質(zhì)：鄰氨基 苯甲酸CoA-連接酶、2-氨基苯甲酰-CoA氨裂合酶、環(huán)己-1-烯-1-羧基-CoA脫氫酶、環(huán) 己-1-烯-1-羧基-CoA水合酶、或2-羥基環(huán)己烷羧基-CoA脫氫酶。在任意表達羧酸還原 酶的重組宿主中，還可以表達磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶來提高所述羧酸還原酶的活性。
[0030] 生產(chǎn)庚二酰-CoA的重組宿主進一步可以包括至少一種編碼以下一種或多種物質(zhì) 的外源性核酸：硫酯酶、醛脫氫酶、7-氧代庚酸脫氫酶、6-氧代己酸脫氫酶、CoA-轉(zhuǎn)移酶、可 逆CoA-連接酶（例如可逆琥珀酰-CoA-連接酶）、乙?；┟摎涿?、或羧酸還原酶，所述宿 主生產(chǎn)庚二酸或庚二酸半醛。
[0031] 生產(chǎn)庚二酸半醛的重組宿主進一步可以包括至少一種編碼轉(zhuǎn)氨酶的外源性 核酸，并生產(chǎn)7-氨基庚酸。
[0032] 生產(chǎn)庚二酸半醛的重組宿主進一步可以包括至少一種編碼以下物質(zhì)的外源性核 酸：4_羥基丁酸脫氫酶、5-羥基戊酸脫氫酶或6-羥基己酸脫氫酶，所述宿主生產(chǎn)7-羥基庚 酸。
[0033] 生產(chǎn)庚二酸半醛、7-氨基庚酸，或7-羥基庚酸的重組宿主進一步可以包括羧酸還 原酶、轉(zhuǎn)氨酶、脫乙酰基酶、N-乙酰轉(zhuǎn)移酶、或醇脫氫酶，所述宿主生產(chǎn)庚二胺。
[0034] 生產(chǎn)7-羥基庚酸的重組宿主進一步可以包括至少一種編碼羧酸還原酶或醇脫氫 酶的外源性核酸，所述宿主生產(chǎn)1，7-庚二醇。
[0035] 所述重組宿主可以是原核生物，例如來自埃希氏菌屬（Escherichia)如大 腸桿菌（Escherichiacoli);來自梭菌屬（Clostridia)如楊氏梭菌（Clostridium ljungdahlii)、自產(chǎn)乙醇梭菌（Clostridiumautoethanogenum)或者克魯佛梭 菌（Clostridiumkluyveri);來自棒狀桿菌屬（Corynebacteria)如谷氨酸棒狀桿 菌（Corynebacteriumglutamicum);來自貪銅菌屬（Cupriavidus)如鉤蟲貪銅菌 (Cupriavidusnecator)或者耐金屬貪銅菌（Cupriavidusmetallidurans);來自假單 胞菌屬（Pseudomonas)如焚光假單胞菌（Pseudomonasfluorescens)、惡臭假單胞菌 (Pseudomonasputida)或者食油假單胞菌（Pseudomonasoleavorans);來自代爾夫特菌 屬（Delftia)如食酸代爾夫特菌（Delftiaacidovorans);來自芽孢桿菌屬（Bacillus) 如枯草芽胞桿菌（Bacillussubtillis);來自乳桿菌屬（Lactobacillus)如德氏乳桿 菌（Lactobacillusdelbrueckii);或者來自乳球菌屬（Lactococcus)如乳酸乳球菌 (Lactococcuslactis)或來自紅球菌屬（Rhodococcus)如馬紅球菌（Rhodococcusequi)。
[0036] 所述重組宿主可以是真核生物，例如，來自曲霉屬（Aspergi1lus)如黑曲 霉（Aspergillusniger);來自酵母屬（Saccharomyces)如釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae);來自畢赤氏酵屬（Pichia)如巴斯德畢赤酵母（Pichiapastoris);來自 耶羅維亞酵母屬（Yarrowia)如解脂耶羅維亞酵母（Yarrowialipolytica);來自伊薩 酵母屬（Issatchenkia)如東方伊薩酵母（Issathenkiaorientalis);來自德巴利酵母 屬（Debaryomyces)如漢遜德巴利酵母（Debaryomyceshansenii);來自Arxula屬如 Arxulaadenoinivorans;或者來自克魯維酵母菌屬（Kluyveromyces)如乳酸克魯維酵母 菌（Kluyveromyceslactis)的真核生物。
[0037] 本文所述的任意重組宿主進一步可以包括一種或多種以下弱化的酶：聚合物合 酶、NADPH特異性L-谷氨酸脫氫酶、NADPH-消耗型轉(zhuǎn)氫酶、庚二酰-CoA脫氫酶；降解C7結 構單元及其前體的?；?CoA脫氫酶；戊二酰-CoA脫氫酶；或庚二酰-CoA合成酶。
[0038] 本文所述的任意重組宿主進一步可以過表達編碼以下物質(zhì)的一種或多種基因： 6_磷酸葡糖酸脫氫酶；轉(zhuǎn)酮醇酶；反饋抗性莽草酸激酶；反饋抗性2-脫氫-3-脫氧磷 酸庚酸酸糖（2 -dehydr〇-3-deoxyphosphoheptanatealdose);吡啶核昔酸轉(zhuǎn)氛酶；甘油 醛-3P-脫氫酶；蘋果酸酶；葡萄糖-6-磷酸脫氫酶；果糖1，6二磷酸酶；鐵氧化還原蛋 白-NADP還原酶、L-丙氨酸脫氫酶；NADH-特異性L-谷氨酸脫氫酶；二胺轉(zhuǎn)運體；二羧酸轉(zhuǎn) 運體；和/或多藥物轉(zhuǎn)運體。
[0039] 本文所述途徑的反應可以在一種或多種細胞（例如宿主細胞）株中進行，所述細 胞株（a)天然表達一種或多種相關酶，（b)經(jīng)遺傳工程化而表達一種或多種相關酶，或（c) 天然表達一種或多種相關酶并經(jīng)遺傳工程化而表達一種或多種相關酶?；蛘?，可以從以上 任意類型的宿主細胞中提取相關酶，并以純化或半純化形式使用。提取的酶可選地固定在 固體基質(zhì)上，例如適合的反應容器的底和/或壁。此外，這些提取物包括可以作為相關酶來 源使用的裂解物（如細胞裂解物）。在本申請?zhí)峁┑姆椒ㄖ?，所有步驟可以在細胞（例如宿 主細胞）中進行，所有步驟可以使用提取的酶進行，或一些步驟可以在細胞中進行，而其它 步驟可以使用提取的酶進行。
[0040] 本文所述的多種酶催化可逆反應，并且感興趣的反應可以是所述反應的逆反應。 圖1-6所示的示意性途徑闡明了對于每種中間物感興趣的反應。
[0041] 除非另外定義，本申請使用的所有技術和科學術語的定義與本發(fā)明所屬領域的普 通技術人員所通常理解的含義相同。雖然與本申請所述的方法和材料相似或者等同的方法 和材料也可用于實踐本發(fā)明，但在下文描述適合的方法和材料。本文提及的所有公開、專利 申請、專利和其它參考文獻通過提述完整并入本文。在沖突的情況下，以本說明書包括定義 為準。另外，材料、方法和實施例僅為示例性的而不意圖限制。
[0042] 本發(fā)明的一個或多個實施方案的細節(jié)列于下面的附圖和描述中。根據(jù)說明書和附 圖，并根據(jù)權利要求，本發(fā)明的其它特征、目的和優(yōu)點將顯而易見。根據(jù)專利法的標準實踐， 詞語"包含"在權利要求中可被"基本上由…組成"或者"由…組成"替代。
[0043] 附圖簡述
[0044] 圖1是從苯甲酸或分支酸（作為中心代謝物）通向庚二酰-CoA的示例性生物化 學途徑的示意圖。
[0045] 圖2是使用庚二酰-CoA作為中心前體通向庚二酸或庚二酸半醛的示例性生物化 學途徑的示意圖。
[0046] 圖3是使用庚二酰-CoA或庚二酸作為中心前體通向7-氨基庚酸的示例性生物化 學途徑的示意圖。
[0047] 圖4是使用7-氨基庚酸、7-羥基庚酸或庚二酸半醛作為中心前體通向庚二胺的示 例性生物化學途徑的示意圖。
[0048] 圖5是使用庚二酰-CoA或庚二酸作為中心前體通向7-羥基庚酸的示例性生物化 學途徑的示意圖。
[0049] 圖6是使用7-羥基庚酸作為中心前體通向1，7-庚二醇的示例性生物化學途徑的 示意圖。
[0050] 圖7含有由tesB編碼的大腸桿菌硫酯酶（參見GenBank登錄號AAA24665. 1， SEQIDN0:1)、海分枝桿菌（Mycobacteriummarinum)駿酸還原酶（參見GenBank登錄號 ACC40567. 1，SEQIDN0:2)、恥垢分枝桿菌（Mycobacteriumsmegmatis)駿酸還原酶（參 見GenBank登錄號ABK71854. 1，SEQIDN0:3)、Segniliparusrugosus駿酸還原酶（參見 GenBank登錄號EFV11917. 1，SEQIDN0:4)、恥垢分枝桿菌羧酸還原酶（參見GenBank登錄 號ABK75684.1，SEQIDN0:5)、馬賽分枝桿菌（Mycobacteriummassiliense)駿酸還原酶 (參見GenBank登錄號EIV11143.1，SEQIDN0:6)、Segniliparusrotundus駿酸還原酶（參 見GenBank登錄號ADG98140.1，SEQIDN0:7)、紫色色桿菌（Chromobacteriumviolaceum) 轉(zhuǎn)氨酶（參見GenBank登錄號AAQ59697.1，SEQIDN0:8)、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa) 〇-轉(zhuǎn)氨酶（參見GenBank登錄號AAG08191. 1，SEQIDN0:9)、丁香假單胞菌 (Pseudomonassyringae)?-轉(zhuǎn)氨酶（參見GenBank登錄號AAY398